[发明专利]利用荧光定量PCR法检测FUT2基因类型的方法

说明书

本发明涉及一种利用荧光定量PCR法检测FUT2基因类型的方法，属于分子生物学技术领域。利用荧光定量PCR法检测FUT2基因类型的方法，获取待测样品全血基因组DNA；利用引物及荧光物质进行荧光定量PCR检测：根据PCR检测后熔解曲线的熔解峰位置判断rs1047781位点的A/T突变情况，进而判断FUT2基因的类型为分泌型或非分泌型。本发明所述方法可以特异性的进行中国人群岩藻糖基转移酶基因Fut2单核苷酸位点多态性(SNP)分析，以明确分泌型/非分泌型并预测母乳岩藻糖基化低聚糖(fHMOs)水平及其母乳喂养的新生儿肠道双歧杆菌和乳酸杆菌的丰度。

技术领域

本发明涉及一种利用荧光定量PCR法检测FUT2基因类型的方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

新生儿肠道有益菌群的定植和健康菌群结构的建立显著影响其生长发育[1,2]。研究显示在新生儿肠道中正常菌群的比例分别为：乳酸杆菌1％、双歧杆菌60％—90％、其他细菌10％—40％，其中双歧杆菌(Bifidobacterium spp.)占据绝对优势地位[3]。双歧杆菌是婴儿肠道中早期定植的生理性厌氧菌，是肠道正常菌群中的优势菌，可以帮助维持婴儿肠道稳态，在婴幼儿成长发育、消化吸收、抗感染、免疫调节等诸多方面起到积极的作用[4,5]。因此，双歧杆菌在婴儿肠道的定植和多样性对保证婴幼儿健康有着重要意义。

婴儿肠道菌群的形成主要受分娩方式、喂养方式、抗生素的使用、环境及遗传等因素的影响，具有较大的波动性。其中，喂养方式的不同对婴儿肠道菌群结构的影响巨大[6]。母乳喂养婴儿肠道菌群构成相对简单，形成以双歧杆菌为优势菌的肠道菌群[7]；而人工喂养婴儿则形成更为多样化的肠道菌群，其肠道内双歧杆菌低于母乳喂养婴儿，而拟杆菌、肠杆菌、肠球菌和梭菌等则高于母乳喂养婴儿[8]。近期国际著名期刊《Science》、《Cell》等相继发表了以“母乳—婴儿肠道菌群—婴儿健康”为主线的重要科研成果[9-11]，证明了母乳关键成份对婴儿健康的重要作用和相关机制。研究显示母乳中的低聚糖(HMO)是诱导母乳喂养儿肠道双歧杆菌优势发育的主要因素[12]。母乳喂养的婴儿肠道双歧杆菌可利用HMO成份，特别是岩藻寡糖类(Fucosylated oligosaccharides)作为碳源而生长繁殖[13]。例如，α1,2-fucosylated HMO成份已被证明能促进B.longum subsp.、B.bifidum subsp.和B.breve等双歧杆菌菌株的生长，这些菌株均含有可降解2’-fucosylated HMO的糖基水解酶95(GH95)或岩藻糖苷酶GH29[14-16]。因此，HMO成份的变化可能直接影响子代肠道菌群的发展，作为一类重要的益生元，HMO是“母乳中不该被忽视的关键营养”。

近年来美国学者研究显示，母亲携带岩藻糖基转移酶2(FUT2)基因的类型(分泌型和非分泌型)不同，所分泌母乳中的HMO成份也有所不同，这直接影响了婴儿肠道双歧杆菌的定植时间和发展[17]。母亲乳腺中的FUT2可通过α1,2-linkage将低聚糖底物岩藻糖基化。由于FUT2基因表达于多种ABO血型人群所分泌的体液中(例如眼泪、唾液、乳汁、等等)，因此被称为“分泌基因(secretor gene)”。该基因的突变可导致其编码的FUT2失活，而FUT2基因单核酸位点多态性(SNP)在全球范围内均被发现[18]。在我国母亲人群的研究中显示，rs601338位点的A/G多态性和rs1047781位点的A/T多态性是控制中国母亲母乳FUT2是否处于活化状态的关键，并且可影响母乳中性寡糖的浓度及α1,2岩藻糖寡糖的比例[19,20,21]。FUT2基因处于活化状态的人群归类为分泌型人群，而处于失活状态的人群则为非分泌型，这两类母亲的子代在诸多方面也存在差异，例如，由分泌型母亲母乳喂养的婴儿发生腹泻的几率更小[22]；不同的分泌型母亲其早产儿的生存率也存在差异[23]；特别是，不同分泌型母亲在哺乳期所分泌母乳中乳糖岩藻糖基化的过程会发生变化[24,25]，因此，这些变化可能直接影响到其子代肠道菌群，特别是双歧杆菌的定植和发展，进而影响婴儿健康。