[发明专利]一种无损伤巴布亚企鹅性别鉴定方法

说明书

本发明公开了一种无损伤巴布亚企鹅性别鉴定方法，属于生命科学领域。本发明以被检巴布亚企鹅个体粪便为DNA来源，粪便在裂解液中裂解后，以粪便裂解液作为模板，利用发明的巴布亚企鹅性染色体引物进行巢式PCR扩增，得到长度差异显著的CHD‑W/CHD‑Z片段，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果判定被检企鹅性别。本发明具有对企鹅无损伤，准确性高并且操作简单等优点。

技术领域

本发明涉及一种无损伤巴布亚企鹅性别鉴定方法，属于生命科学领域。

背景技术

对于非平胸鸟类的性别鉴定，目前最准确的方法是分子鉴定法，该方法是利用位于性染色体上CHD基因(chromobox-helicase-DNA binding gene，染色体螺旋蛋白基因)的内含子长度差异来判定性别，即如果扩增的CHD片段在Z/W染色体上有足够的长度差异，则雌性鸟类的扩增结果通过电泳应显示两条带，雄性则显示1条带。关于这一方法，国外学者先后总结了几对较为通用的CHD基因扩增引物(P1/P2，P2/P8，2550F/2718R)，这些引物对于大多数非平胸目鸟类都可以扩增得到产物，然而其产物在雌雄个体间差异是否显著，则因物种不同而异。

巴布亚企鹅又称白眉企鹅，属于企鹅目，企鹅科。企鹅是单态鸟类，在其配对产卵前难以通过外形分辨雌雄。由于多数企鹅实行一夫一妻制，在执行珍稀动物保种计划或极地馆引种计划时，均希望按照一比一性比进行配对操作，因此，年幼企鹅的性别鉴定方法引起了人们的重视。前人总结的两对通用引物(P2/P8，2550F/2718R)已在多种企鹅中进行了可行性验证。然而，企鹅性别鉴定过程中，一般采用抽取血液或拔取多根羽毛以获得DNA样本，这两种方法对受检个体尤其是幼体会产生不良影响；同时，利用2550F/2718R引物进行扩增时，由于CHD-W与CHD-Z扩增产物之间的差异接近80bp(CHD-W扩增全长约为740bp)，这一结果导致企鹅性别鉴定时需要进行聚丙烯酰胺凝胶电泳才能清晰的区分性别。

发明内容

鉴于上述弊端，本发明的目的在于提供一种无损伤、准确性高且操作简单的巴布亚企鹅性别鉴定方法。

本发明的技术方案包括以下具体步骤：刚排出体外的新鲜企鹅粪便或保存于-20℃不超过3个月的新鲜企鹅粪便在裂解液中裂解，以粪便裂解液作为初始模板进行巢式PCR扩增，第二次PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果判定被检企鹅性别。

本发明利用裂解液裂解微量粪便直接充当被检个体DNA模板，这一方法省略了提取DNA所需操作，同时解决了微量样品提取DNA的低得率问题。裂解液组分(体积百分比)为：6％-8％蛋白酶K(20mg/L)溶液，0.4％-0.6％吐温-20，10％10×Taq Buffer，其余为纯水，Taq Buffer为后续PCR扩增时所用Buffer。裂解液中蛋白酶K使细胞膜蛋白水解；吐温-20可促使细胞破碎，进而使DNA释放；虽然不同厂家生产的不同种Taq都配有经过优化的、组分不尽相同的Taq Buffer，但其主要组分均为Tris-Hcl、KCl或NaCl和DTT等，这些组分与商品化的细胞裂解液组分相似，可以为蛋白酶K水解作用提供必要的离子环境。同时，使用本发明所述Taq Buffer配制裂解液可在后续的PCR反应液中扣除模板中所含Taq Buffer，避免引入商品化裂解液时模板中各组分对PCR反应的干扰，以保证PCR扩增的高效性和准确性。

本发明利用裂解液裂解粪便的温度条件为：55℃维持20-30分钟后85℃维持15分钟。55℃为蛋白酶K最适反应温度，85℃则使蛋白酶K灭活以消除其对后续扩增的影响。

本发明放弃使用非平胸鸟类通用引物，利用巴布亚企鹅CHD基因序列设计新引物，使PCR产物长度缩短，在提高PCR扩增效率的同时，增加了CHD-W/CHD-Z长度差异与CHD-W长度之比，使扩增产物仅需普通琼脂糖凝胶电泳即可清晰分辨雌雄。巢式PCR第一次扩增引物的核苷酸序列是：

正向引物：SEQ ID NO.1：5`-GAACGTGGCAACAGAGTACTGA-3`；