[发明专利]一种实时荧光定量PCR仪校准用标准物质及其应用

说明书

本发明提供了一种实时荧光定量PCR仪校准用标准物质。本发明首次采用系列质粒DNA标准物质对实时荧光定量PCR仪进行计量校准。其优点是制备简单，量值准确，使用方面，定值不确定度评定合理，溯源途径清晰，可溯源到国家级标准物质。标准物质量值范围宽：E0 copy/μL‑E+8 copy/μL，跨越9个数量级；适用性强：适用于市场上现行所有实时荧光定量PCR仪的计量校准。本发明可有效支撑国家计量技术规范《聚合酶链反应分析仪(PCR)校准规范》JJF1527‑2015实行。

技术领域：

本发明属于生物、化学分析领域，具体涉及一种实时荧光定量PCR仪校准用标准物质及其应用。

背景技术：

聚合酶链式反应(PCR)，是一种DNA的快速扩增技术，通过两对引物DNA片段和一种耐热的酶的作用，可以在2个小时内把特定的DNA量提高1000万倍。PCR技术使分子生物学研究获得了质的突破，而且随着PCR技术的日趋完善，特别是荧光定量PCR仪的出现，克服了过去易污染等技术问题，荧光定量PCR仪在各类医学实验室、司法鉴定实验室、检验检疫实验室和基因测序公司等都广泛应用。

荧光定量PCR仪一个重要因素是定量性能，主要反应在定量线性范围和仪器分辨率。对目标DNA的定量分析是基因临床诊断、转基因产品检测、法医DNA鉴定等的重要手段，荧光定量PCR仪是完成此功能的仪器，该仪器可完成多样品DNA快速体外扩增，并用荧光检测的方法，实时定量测定目标DNA片段的含量。

荧光定量PCR仪现在在各检验检疫实验室、临床检测实验室、血液制品中心等得到了广泛的应用。鉴于各实验室逐渐以独立第三方身份发挥职责和作用，为提高实验室权威性、公正性及业务水平，增强客户的信赖性，扩大业务量，各实验室计量认证和实验室认可的需求越来越多，而荧光定量PCR仪是微量核酸定量测量必需的主要设备之一，检定校准的需求量越来越大。因此研制实时荧光定量PCR仪校准必需的标准物质具有重要的社会意义，并且经济效益明显。

荧光定量PCR校准分为两部分，一是温度指标校准，用经过校准的专用温度标准器进行校准；二是定量示值误差和线性校准，需要使用认证的国家级标准物质进行校准。标准物质特性量值必须涵盖：1.0E+02copy/μL到1.0E+08copy/μL这个范围。由于用于荧光定量PCR仪器校准的DNA样品纯度、定量精度、制备工艺等要求很高，一般的仪器试剂公司现在还不能达到，因此荧光定量PCR仪校准用DNA样品还没有其它仪器和试剂公司能够提供，是各国计量机构急需解决的难题之一。

发明内容：

本发明的目的是提供一种用于实时荧光定量PCR仪校准用的标准物质，为实时荧光定量PCR仪计量校准提供标准支撑。

荧光定量PCR仪器校准用的标准物质的特性量值必须涵盖：1.0E+02copy/μL到1.0E+08copy/μL这个范围，经分析研究，EGFR-1(18-；19-，20-；21-)为经过认证的国家级标准物质，其特性量值1.28E+14copy/μL，通过研究确定其可以用重量法配制成需要的各种版型的标准物质。同时，该标准物质整合的目标基因，可以用FAM标记的探针和相对应的引物进行PCR扩增，PCR扩增效率达到99％左右，线性范围良好，R2值达到0.99，重复性良好，稳定性良好。该标准物质在多达上千台仪器上验证后，不因仪器种类改变，性能改变，可以很好的反应仪器的性能指标。

其中，EGFR-1全长核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，全长氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；EGFR-1的外显子18的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示；EGFR-1的外显子19核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示；EGFR-1的外显子20核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示；EGFR-1的外显子21核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示。