[发明专利]一种制备、纯化HOPS复合物蛋白的方法

权利要求书

1.一种制备、纯化HOPS复合物蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）设计用于扩增组成人HOPS复合体的6种基因的编码区的引物；所述的6种基因为：人VPS11基因、人VPS18基因、人VPS39基因、人VPS16基因、人VPS33基因、人VPS41基因；分别扩增得到人VPS11基因、人VPS18基因、人VPS39基因、人VPS16基因、人VPS33基因、人VPS41基因片段；

2）分别构建pET-His-NusA-TEV-HA-VPS11、pET-His-NusA-TEV-HA-VPS18、pET-His-NusA-TEV-HA-VPS39的重组质粒；分别构建pGEX 4T-1- GST-TEV-Flag-VPS16、pGEX 4T-1-GST-TEV-Flag-VPS33、pGEX 4T-1- GST-TEV-Flag-VPS41的重组质粒；

3）将步骤2）构建的6种重组质粒分别转化大肠杆菌细胞，再进行融合蛋白的诱导表达和分离纯化；

其中，针对pET-His-NusA-TEV-HA-VPS11、pET-His-NusA-TEV-HA-VPS18、pET-His-NusA-TEV-HA-VPS39，IPTG诱导表达，且在22°C条件下诱导16 h，IPTG诱导终浓度为0.2mmol/L，然后采用Ni柱亲和层析的方法纯化蛋白；

针对pGEX 4T-1- GST-TEV-Flag-VPS16、pGEX 4T-1- GST-TEV-Flag-VPS33、pGEX 4T-1- GST-TEV-Flag-VPS41，IPTG诱导表达，IPTG诱导终浓度为0.2 mmol/L，诱导温度为28°C，诱导时间为5 h，然后采用谷胱甘肽琼脂糖树脂亲和层析的方法纯化蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种制备、纯化HOPS复合物蛋白的方法，其特征在于，用于扩增组成人HOPS复合体的6种基因的编码区的引物包括：

a.用于扩增人VPS11基因的上下游引物

VPS11基因上游引物：

5'-CTGGTGAGAACCTGTACTTCCAATCCGGATCCTACCCCTAC

GACGTGCCCGACTA-3'，下游引物：5'-TCCTCTTCAGAGATGAGTTTCTGCTCAAGCTTTT

AAGTGCCCCTCCTGGAGTGC-3'；

b.用于扩增人VPS18基因的上下游引物

VPS18基因上游引物：5'-CTGGTGAGAACCTGTACTTCCAATCCGGATCCTACCCCTAC

GACGTGCCCGACTA-3'，下游引物：5'-TCCTCTTCAGAGATGAGTTTCTGCTCAAGCTTCT

ACAGCCAACTGAGCTGCTCCTC-3'；

c.用于扩增人VPS39基因的上下游引物

VPS39基因上游引物：5'-CTGGTGAGAACCTGTACTTCCAATCCGGATCCTACCCCTAC

GACGTGCCCGACTA-3'，下游引物：5'-TCCTCTTCAGAGATGAGTTTCTGCTCAAGCTTCT

AAGTGTCAGCTGGGTTTACCTC-3'；

d.用于扩增人VPS16基因的上下游引物

VPS16基因上游引物：5'-CCGGAATTCATGGACTGCTACACGGCGAAC-3'，下游引物：ATTTGCGGCCGCCTACTTCTTCTGGGCTTGTGCCCT-3'；

e.用于扩增人VPS33基因的上下游引物

VPS33基因上游引物：5'-ACAAGGGATCCCCGGAATTCATGGCGGCTCATCTGTCC-3'，下游引物：5'-CAGTCAGTCACGATGCGGCCGCCTAGAAAGGTTTTTCCATCAG-3'；

f.用于扩增人VPS41基因的上下游引物

VPS41基因上游引物：5'-CGCGGATCCATGGCGGAAGCAGAGGAGCAGGAAAC-3'，下游引物：5'-ATTTGCGGCCGCCTATTTTTTCATCTCCAAAATTGCAC-3'。