[发明专利]一种制备、纯化HOPS复合物蛋白的方法

说明书

本发明涉及一种制备、纯化HOPS复合物蛋白的方法，包括如下步骤：1）设计用于扩增组成人HOPS复合体的6种基因的编码区的引物；2）分别构建pET‑His‑NusA‑TEV‑HA‑VPS11、pET‑His‑NusA‑TEV‑HA‑VPS18、pET‑His‑NusA‑TEV‑HA‑VPS39的重组质粒；分别构建pGEX 4T‑1‑GST‑TEV‑Flag‑VPS16、pGEX 4T‑1‑GST‑TEV‑Flag‑VPS33、pGEX 4T‑1‑GST‑TEV‑Flag‑VPS41的重组质粒；3）将步骤2）构建的6种重组质粒分别转化大肠杆菌细胞，再进行融合蛋白的诱导表达和分离纯化。本发明可以简便地获得高特异性的HOPS复合物蛋白，为膜蛋白的分离纯化提供了更好的方法，能够为生物化学等基础研究提供支持。

技术领域

本发明涉及一种制备、纯化HOPS复合物蛋白的方法。

背景技术

蛋白质的纯化制备是一项重要的操作技术，在生物化学研究中应用广泛。膜蛋白是构成生物膜系统的关键组分，同时在多种细胞生命活动中发挥重要作用，但由于膜蛋白具有疏水性强、丰度低等理化性质，其提取制备一直存在着效率低、纯度低等问题。

同型融合和蛋白质分选（homotypic fusion and vacuole protein sorting,HOPS）复合物由六种79-123 kDa的蛋白组成，包括VPS11、VPS16、VPS18、VPS33、VPS39和VPS41。HOPS复合物在进化上很保守，参与细胞内的膜泡运输，对于酵母中吞噬泡与液泡，以及哺乳动物细胞中自噬体与溶酶体融合的过程至关重要。

细胞自噬广泛存在于真核生物中，是细胞内物质代谢的重要途径，在生长发育和多种疾病中发挥着关键作用。自噬体包裹着错误折叠蛋白、损伤的细胞器等待降解物质，通过与溶酶体融合，形成自噬溶酶体，完成底物的降解，因此膜融合是自噬过程的关键步骤。HOPS复合物、SNARE复合物、Rab GTP酶等介导了自噬体-溶酶体融合的过程。其中，HOPS复合物通过与SNARE蛋白STX17相互作用促进自噬体与溶酶体的膜融合过程。因此，纯化、制备HOPS蛋白复合物，将有助于揭示自噬及其他膜融合过程的机制。

HOPS是一种膜结合蛋白复合物，现有技术中，膜蛋白的纯化制备是一大难点：膜蛋白的疏水性使其容易沉降和聚集，且对于溶解条件要求苛刻；和胞质蛋白相比，膜蛋白的丰度低；复杂的翻译后修饰、跨膜区较少的酶切位点等特点都增加了其提取、纯化的难度。这就导致了膜蛋白的纯化需要大量的起始细胞，且纯化过程繁琐，获得的蛋白纯度不够等问题。

发明内容

针对这些缺点，本发明提供了一种较为简便、高效地在体外诱导表达并纯化HOPS蛋白的方法，可以得到高纯度的膜蛋白。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种制备、纯化HOPS复合物蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）设计用于扩增组成人HOPS复合体的6种基因的编码区的引物；所述的6种基因为：人VPS11基因、人VPS18基因、人VPS39基因、人VPS16基因、人VPS33基因、人VPS41基因；分别扩增得到人VPS11基因、人VPS18基因、人VPS39基因、人VPS16基因、人VPS33基因、人VPS41基因片段；

2）分别构建pET-His-NusA-TEV-HA-VPS11、pET-His-NusA-TEV-HA-VPS18、pET-His-NusA-TEV-HA-VPS39的重组质粒；分别构建pGEX 4T-1-GST-TEV-Flag-VPS16、pGEX 4T-1-GST-TEV-Flag-VPS33、pGEX 4T-1-GST-TEV-Flag-VPS41的重组质粒；

3）将步骤2）构建的6种重组质粒分别转化大肠杆菌细胞，再进行融合蛋白的诱导表达和分离纯化；