[发明专利]一种2型猪链球菌apuA基因敲除突变株及其应用

权利要求书

1.一种2型猪链球菌apuA基因敲除突变株，其特征在于，所述2型猪链球菌apuA基因敲除突变株为ΔapuA，2型猪链球菌apuA基因敲除突变株ΔapuA，已于2019年1月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学校内中国典型培养物保藏中心，该微生物的保藏号为CCTCC NO：M2019041。

2.一种如权利要求1所述2型猪链球菌apuA基因敲除突变株的构建方法，其特征在于，所述2型猪链球菌apuA基因敲除突变株的构建方法包括：由2型猪链球菌菌株SC19中的apuA基因部分片段被红霉素抗性基因盒代替后所得；apuA基因全长6285bp，选择apuA基因的启动子93bp与apuA基因的5’端2593bp共计2686bp的片段进行缺失获得。

3.如权利要求2所述的2型猪链球菌apuA基因敲除突变株的构建方法，其特征在于，SC19是2型猪链球菌强毒株，分离自2005年四川省SS2疫区的感染猪只，GenBank登录号：NZ_MNPY00000000。

4.如权利要求2所述的2型猪链球菌apuA基因敲除突变株的构建方法，其特征在于，所述的2型猪链球菌apuA基因敲除突变株的构建方法具体包括：

(1)以SC19菌株基因组DNA为模板，扩增apuA基因启动子上游1000bp和apuA基因5’端下游1000bp序列；以pAT18质粒为模板，扩增红霉素抗性基因盒序列erm⁺；

(2)将步骤(1)得到的三个片段的基因序列，按上游-erm⁺-下游的顺序定向连接到温敏型自杀性穿梭载体pSET4S中，得到重组自杀性穿梭质粒pSET4S-ΔapuA；

(3)经测序鉴定正确后，将自杀性质粒pSET4S-ΔapuA转入SC19菌株中，筛选具有红霉素抗性的单克隆，利用荧光定量PCR获得2型猪链球菌apuA基因敲除突变株ΔapuA。

5.如权利要求4所述的2型猪链球菌apuA基因敲除突变株的构建方法，其特征在于，步骤(3)的具体为：

1)制备2型猪链球菌SC19菌株的感受态细胞，加入pSET4S-ΔapuA质粒，混匀后进行电击，复苏后将菌液涂布在含壮观霉素spc的大豆胰蛋白琼脂培养基TSA平板上，28℃温箱中恒温培养48h，得到含有穿梭质粒的猪链球菌单克隆；

2)将具有壮观霉素抗性的单克隆接种于含有红霉素的大豆胰蛋白肉汤TSB液体培养基中，37℃恒温传代培养；过程会发生同源重组，温敏型穿梭质粒pSET4S会丢失；将传代培养的菌液稀释后涂布于含红霉素的TSA平板，置于37℃培养12h后，通过抗性筛选疑似apuA基因敲除突变株；

3)经RT-PCR鉴定后证实apuA基因被红霉素抗性基因盒序列erm⁺所取代，获得了2型猪链球菌apuA基因敲除突变株ΔapuA。

6.一种如权利要求1所述2型猪链球菌apuA基因敲除突变株在分析ApuA影响SS2致病性的分子机制的应用。

7.一种利用权利要求1所述2型猪链球菌apuA基因敲除突变株制备的2型猪链球菌减毒活疫苗。

8.一种利用权利要求1所述2型猪链球菌apuA基因敲除突变株制备的多价基因工程疫苗。