[发明专利]一种2型猪链球菌apuA基因敲除突变株及其应用

说明书

本发明属于基因工程领域，公开了一种2型猪链球菌apuA基因敲除突变株及其应用，2型猪链球菌apuA基因敲除突变株为ΔapuA，2型猪链球菌apuA基因敲除突变株ΔapuA，已于2019年1月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学校内中国典型培养物保藏中心，该微生物的保藏号为CCTCC NO：M2019041。本发明构建的apuA基因敲除突变株ΔapuA，可用于研究ApuA作为毒力因子影响SS2致病性的分子机制，为进一步研究SS2的致病机理奠定了基础，也可用于研制2型猪链球菌减毒活疫苗或基因工程多价疫苗。

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种2型猪链球菌apuA基因敲除突变株及其应用。

背景技术

目前，最接近的现有技术：

猪链球菌(Streptococcus suis，SS)是一种重要的人兽共患病原菌，分为33 种血清型，其中猪链球菌2型(SS2)被认为是分布最广、致病性最强的一种血清型，可导致感染猪和人的急性出血性败血症、脑膜炎、肺炎、关节炎等，发病率和死亡率高，不仅给养猪业造成巨大的经济损失，也对公共卫生、食品安全和人类的生命安全构成威胁。

我国于1998年和2005年在江苏和四川暴发两次大规模的猪及人感染SS2 疫情，累计报告人感染SS2病例达229例，死亡52例，引起我国卫生部门对猪链球菌病的高度重视。近年来，猪链球菌病的发病率和死亡率逐年上升，各地 SS分离株的耐药情况亦呈逐年加重的趋势，严重威胁人类公共卫生和生猪养殖产业。但是，目前关于SS2感染宿主并致病的分子机制仍不清楚。

结合近年来SS的研究进展，目前已鉴定的毒力相关因子大体可分为以下三类：(1)胞膜锚定蛋白/分泌蛋白，如荚膜多糖(CPS)、溶菌酶释放蛋白(MRP)、胞外因子(EF)、溶血素(Sly)等；(2)酶类，如谷氨酸脱氢酶(Gdh)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)等；(3)转录因子/调控因子，如糖代谢转录调控因子(CcpA)、丝氨酸/苏氨酸磷酸激酶(STK)等。

目前，很多发掘出的毒力因子都处于推测和假定的状态，缺乏进一步实验证明这些潜在毒力因子与SS2毒力的确切关系及其致病机制。

在SS2毒力因子的研究过程中，国内外许多学者通过构建某一基因的敲除突变株，并与野生株比较毒力变化，来揭示该基因在SS2致病中的作用，也为新型疫苗的研发奠定了理论基础。疫苗是一种安全有效的病原菌防控手段，特别是减毒活疫苗和亚单位疫苗。减毒活疫苗以全菌体为基础，用量小、免疫原性好，而且免疫期长、使用方便，亚单位疫苗具有组分清楚、安全性好、便于产业化、技术成熟等优点，成为SS2新型疫苗研发的两个重要方向。

SS2的ApuA是一个双功能淀粉酶，由SS2的apuA基因编码，含有6285 个碱基对(bp)，有保守的α-淀粉酶和普鲁兰酶的底物结合、催化结构域，并具有保守的LPNTG基序，这是革兰氏阳性菌表面蛋白质的典型特征。在已有详细研究的同源淀粉酶中，ApuA与肺炎链球菌的SpuA、A群链球菌的PulA和无乳链球菌的SAP，分别具有58％、58％和55％的氨基酸序列同源性。SpuA已被证实是肺炎链球菌主要的毒力因子，与二型肺泡细胞糖原有高度亲和性。PulA可介导A群链球菌黏附5种人口咽腔肿瘤细胞系(牙龈、喉、舌、扁桃体和鼻)。 SAP介导B群链球菌对人宫颈上皮细胞的黏附，其亚单位疫苗可有效的预防病原菌在宿主体内的定植。2010年，Ferrando等在SS2菌株Strain 10中，将壮观霉素抗性基因盒插入apuA基因的3114bp处，使apuA基因的普鲁兰酶编码序列无法表达，但保留apuA基因的启动子及其α-淀粉酶编码序列。Ferrando发现， ApuA可以促进猪链球菌对猪气管上皮细胞的黏附，是假定的毒力因子。但是，目前尚无直接证据证实ApuA是SS2的黏附素和毒力因子，其在SS2致病过程中所起的作用也尚不清楚。

综上所述，现有技术存在的问题是：