[发明专利]一种胞外囊泡/外泌体的数字PCR检测方法

说明书

一种胞外囊泡/外泌体的数字PCR检测方法，属于生物技术及医学检测技术领域。其特征在于包含如下操作步骤：1）将胞外囊泡/外泌体与微球孵育结合；2）将结合后的胞外囊泡/外泌体进行数字核酸扩增检测，定量。相对于现有技术，本发明具有如下有益效果:1.可以实现胞外囊泡/外泌体的精确绝对定量；2.实现本发明所需的原料简便易得，操作简单，对设备无特殊要求，成本低廉；3.适用范围广，可以同时提供特异性和非特异性两种定量方式。

技术领域

本发明属于生物技术及医学检测技术领域，具体涉及一种胞外囊泡/外泌体的数字PCR检测方法。

背景技术

胞外囊泡是一种细胞在生理过程中产生的的一类具有脂质双分子层结构的纳米囊泡，粒径分布为30-1000 nm。其中，外泌体是胞外囊泡的一种，粒径分布为30-100 nm,其表面带有多种标志蛋白如CD63和其他特有蛋白，其内部含有DNA、RNA和多种蛋白。纳米尺度的外泌体可以在循环系统和细胞间穿梭，进行物质和信息的传递，起到在细胞间相互通讯的作用。其中，某些细胞如胰腺癌肿瘤细胞可分泌带有GPC-1表面蛋白的特殊外泌体，可作为疾病的筛查和诊断的生物标志物。另外，不同细胞或组织分泌的外泌体数目存在显著差异。因此建立一种外泌体定量分析方法在临床和科研领域都具有十分重要的意义。

但是由于外泌体的粒径太小，通常的荧光显微镜检测、流式细胞检测等技术无法准确地对外泌体进行检测和定量。目前常用的定量手段有蛋白定量法，通过粗略地定量胞外囊泡/外泌体样品中蛋白的含量，对样本进行定量，此方法方便易行但不够准确。其他的纳米颗粒跟踪分析（NTA）技术、动态光散射（DLS）技术、qnano定量技术等仪器贵重，检测成本较大。。

目前数字PCR方法是一种定量检测核酸的技术，其基本原理是将有限的DNA分子随机分配到大量的液滴或小室中，如果液滴的数量足够多，那么DNA分配到液滴或小室中时，根据泊松分布，一个DNA分子独占一个液滴或小室，两个或两个以上DNA分子共同占有一个液滴或小室的概率非常低。然后再对液滴或小室中的核酸分子进行扩增，拥有核酸的液滴或小室将呈现阳性信号。最后通过统计阳性液滴或小室的数量可实现核酸分子的定量。

这一策略也可用于胞外囊泡/外泌体的定量分析。将标记的胞外囊泡/外泌体随机分配到液滴或小室中，通过信号扩增，最后获得胞外囊泡/外泌体的数量。但是，胞外囊泡/外泌体本质上也是油包水液滴结构，当胞外囊泡/外泌体分配到可进行数字PCR的液滴中时，胞外囊泡/外泌体会从液滴的液相中游离到油相中，导致检测产生巨大误差。

基于这一现实，本发明提出了一种方法，将胞外囊泡/外泌体吸附在较大的微球表面，然后分配到可以进行数字核酸检测的油包水液滴中，阻挡胞外囊泡/外泌体的逃逸，提高检测的准确性。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种胞外囊泡/外泌体的数字PCR检测方法的技术方案。

所述的一种胞外囊泡/外泌体的数字PCR检测方法，其特征在于包含如下操作步骤：

1）将胞外囊泡/外泌体与微球孵育结合；

2）将结合后的胞外囊泡/外泌体进行数字核酸扩增检测，定量。

所述的一种胞外囊泡/外泌体的数字PCR检测方法，其特征在于所述步骤1）中微球为功能性微米纳米尺寸的微球包括但不限于纳米磁珠、聚苯乙烯微球和琼脂糖微球，优选为纳米磁珠和聚苯乙烯微球。

所述的一种胞外囊泡/外泌体的数字PCR检测方法，其特征在于所述步骤1）中胞外囊泡/外泌体与微球结合方式为包括但不限于非特异性吸附和分子结合方式，所述非特异性结合包括但不限于微球胞外囊泡/外泌体相互吸附，所述分子结合包括但不限于抗体-抗原作用、DNA杂交结合、链霉亲和素-生物素结合。