[发明专利]一种具有ACE抑制活性的核桃粕多肽及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种具有ACE抑制活性的核桃粕多肽，其特征在于：所述核桃粕多肽是氨基酸序列为Val-Glu-Arg-Gly-Arg-Arg-Ile-Thr-Ser-Val和Phe-Val-Ile-Glu-Pro-Asn-Ile-Thr-Pro-Ala的混合物。

2.一种权利要求1所述的具有ACE抑制活性的核桃粕多肽的制备方法，其特征在于该方法由下述步骤组成：

(1)制备核桃粕脱脂粉

将榨油后的核桃粕在40～50℃鼓风干燥箱中干燥，粉碎过60～80目筛，然后按料液比为1g﹕10～20mL加入沸程为30～60℃的分析纯石油醚，除去剩余的核桃油，得到核桃粕脱脂粉；

(2)提取核桃谷蛋白-1

①按料液比为1g﹕10～30mL，向核桃粕脱脂粉中加入去离子水，室温搅拌提取2～3h，过滤，收集滤液，将滤渣再反复提取3次，合并收集的滤液；

②将步骤①合并后的滤液在4～10℃、10000～12000rpm的条件下离心15～20min，按料液比为1g﹕10～30mL向所得沉淀中加入0.4～0.5mol/L的氯化钠水溶液，室温下震荡提取2～3h，过滤，收集滤液，滤渣再反复震荡提取3次，合并收集的滤液；

③将步骤②合并后的滤液在4～10℃、10000～12000rpm的条件下离心15～20min，按料液比为1g﹕10～30mL向所得沉淀中加入体积浓度为50％～70％的乙醇水溶液，室温搅拌2～3h，过滤，收集滤液，滤渣再反复震荡提取3次，合并收集的滤液；

④将步骤③合并后的滤液在4～10℃、10000～12000rpm的条件下离心15～20min，所得沉淀用去离子水清洗后，按料液比为1g﹕10～30mL向沉淀中加入体积浓度为40％～60％的冰乙酸水溶液，室温搅拌2～3h，过滤，收集滤液，滤渣再反复震荡提取3次，合并收集的滤液；

⑤将步骤④合并后的滤液在4～10℃、10000～12000rpm的条件下离心15～20min，上清液装入截留分子量为3000～6000透析袋中，在4～6℃的蒸馏水中透析12～24小时，透析结束后，将透析液在4～10℃、8000～12000rpm的条件下离心15～20min，收集沉淀，真空冷冻干燥，得核桃谷蛋白-1；

(3)限制性酶水解

按料液比为1～4g﹕100mL，将核桃谷蛋白-1溶解于0.1～0.3mol/L磷酸缓冲液中，用0.1mol/L的盐酸调节pH至1.0～3.0，加入核桃谷蛋白-1质量2％～5％的胃蛋白酶，在30～50℃下震荡酶解2～6h，将酶解液在90～100℃下灭酶5～10min；将灭酶后的酶解液在4～6℃、10000～15000rpm的条件下离心20～30min，收集上清液，冷冻干燥后得到核桃谷蛋白-1多肽初提物；

(4)凝胶色谱分离

将核桃谷蛋白-1多肽初提物溶解于去离子水中，配制成50～150mg/mL的溶液，然后对所得溶液进行柱层析分离，柱长0.6～1.2m，直径16～26mm，固定相为Sephadex G-15，纯水洗脱，洗脱流速为0.4～0.8mL/min，洗脱液在220nm处用分光光度计比色，收集分离的第2个多肽组分，冷冻干燥；

(5)反相高效液相色谱纯化

将上述凝胶色谱分离所得到的第2个多肽组分溶解于去离子水中配成10～20mg/mL的溶液，过0.22μm滤膜，收集滤液；将滤液进行反相高效液相色谱分离，所用分离柱为碳18半制备柱，流动相A为含0.1％三氟乙酸的乙腈、流动相B为超纯水，进行梯度洗脱，流动相梯度选择0到20分钟A:B为5％:95％，20～50分钟A:B为25％:75％，流速2.0～2.5mL/min，柱温30～40℃，检测波长220nm；收集分离的第5个和第8个多肽组分，冷冻干燥，得到具有ACE抑制活性的核桃粕多肽。