[发明专利]一种利用PCR-ELISA检测PCV-2的方法

权利要求书

1.一种利用PCR-ELISA方法检测PCV-2的特异性引物对，其特征在于，所述特异性引物对的核苷酸序列如下：

上游引物：5’-GCGGTGGACATGATGAGATT-3’；SEQ ID NO.1；

下游引物：5’-GTTATGGTATGGCGGGAGG-3’；SEQ ID NO.2；

所述上游引物5’端利用地高辛标记，所述下游引物5’端利用生物素标记。

2.一种利用PCR-ELISA以非诊断治疗为目的检测PCV-2的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：PCV-2基因的PCR扩增：

S11：提取样品DNA，得到扩增模板DNA；

S12：使用权利要求1所述的特异性引物对进行PCR反应，特异性扩增步骤S11得到的模板DNA；

S2：ELISA检测分析：

S21：用链霉亲和素包被酶标板；

S22：将步骤S1得到的扩增产物与稀释液按照1：8-10的体积比进行混合后，加入到步骤S21制得的酶标板中，37℃温浴30min；

S23：温育结束后，吸出酶标板中的液体，加入漂洗液对其进行洗涤，每次洗完后甩干，重复三次，之后加入浓度为0.20μl/ml的抗地高辛抗体，35-40℃孵育50-70min；

S24：孵育结束后，吸出酶标板中的液体，加入漂洗液对其进行洗涤，每次洗完后甩干，重复5次，之后加入显色剂，避光反应5-10min；

S25：向酶标板中加入终止液，后在450nm下检测吸光值。

3.根据权利要求2所述的一种利用PCR-ELISA以非诊断治疗为目的检测PCV-2的方法，其特征在于，步骤S12中PCR扩增体系包括：模板DNA溶液1μl、上下游引物各1μl、Ex Taq DNA聚合酶0.5μl、dNTP为2μl、10x buffer5μl、灭菌去离子水39.5μl。

4.根据权利要求3所述的一种利用PCR-ELISA以非诊断治疗为目的检测PCV-2的方法，其特征在于，步骤S12中PCR扩增条件为：96℃预变性1min；98℃变性10s；54.8℃退火30s；72℃延伸25s；扩增30个循环；最后72℃延伸10min，PCR扩增产物4℃保存。

5.根据权利要求2所述的一种利用PCR-ELISA以非诊断治疗为目的检测PCV-2的方法，其特征在于，步骤S21的具体方法为：向酶标板孔中加入2.5μg/ml的链霉亲和素溶液100-150μl，4℃包被过夜，倒出板孔中液体，并甩干，加入300μl漂洗液洗涤板孔，每次洗完后甩干，重复三次。

6.根据权利要求2所述的一种利用PCR-ELISA以非诊断治疗为目的检测PCV-2的方法，其特征在于，步骤S22所述稀释液为PBS缓冲液。

7.根据权利要求2所述的一种利用PCR-ELISA以非诊断治疗为目的检测PCV-2的方法，其特征在于，所述漂洗液为PBST，所述PBST为0.5％Tween20的PBS缓冲液。

8.根据权利要求2所述的一种利用PCR-ELISA以非诊断治疗为目的检测PCV-2的方法，其特征在于，步骤S24所述显色剂为TMB显色液。

9.根据权利要求2所述的一种利用PCR-ELISA以非诊断治疗为目的检测PCV-2的方法，其特征在于，步骤S25所述终止液为2M的硫酸溶液。