[发明专利]一种利用PCR-ELISA检测PCV-2的方法

说明书

本发明公开了一种利用PCR‑ELISA检测PCV‑2的方法，具体包括：提取样品DNA，得到扩增模板DNA；利用特异性引物对，进行PCR反应，特异性扩增模板DNA；将扩增产物进行ELISA检测分析。本发明提供了一种以非诊断治疗为目的利用PCR‑ELISA检测PCV‑2的方法，有效地将PCR和ELISA方法结合，对PCV‑2进行检测，具有特异性强、灵敏度高并且检测方法操作简单、快速等优点。

技术领域

本发明涉及分子生物学检测领域，特别是涉及一种利用PCR-ELISA检测PCV-2的方法。

背景技术

猪圆环(Porcine circo，PC)是指以2-型圆环病毒(2-Porcine circo diseasevirus，PCV-2)为主要病原、单独或继发或混合感染其它致病微生物的一系列疾病的总称。PCV-2感染能够通过多种途径进行传播，造成不同程度的感染发病，是严重影响规模化养猪业发展和智能化清洁生产的一种重要病毒，主要以环境中的空气、饲料、饮水、器具、粪便等作为媒介进行传播。

现有技术中PCV-2常规的检测方法是琼扩试验，这种方法虽操作简单，但是耗时长，敏感性低；近年来发展起来的分子和免疫学诊断方法主要是PCR技术和ELISA技术，PCR检测技术具有高的灵敏性，但易出现假阳性结果，且结果需要进行电泳判定，需要接触有毒性的EB染料而具有局限性；荧光定量PCR技术也因其敏感性高、特异性强而得到广泛认可，但设备昂贵、成本高与荧光探针保存时间较短等限制了该方法的推广；ELISA方法操作简单，不需要昂贵的仪器，适合大规模流行病学调查，但需要制备高特异性抗体，且敏感度较低。这些方法均不能满足对PCV-2准确、经济、稳定的检测需求。

因此，提供一种操作简便、灵敏度高、特异性强的以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA检测PCV-2的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种利用PCR-ELISA检测PCV-2的方法，具有特异性强、灵敏度高并且检测方法操作简单、快速等优点。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

根据Genbank：JF272498.1公开的PCV-2基因高保守区序列，设计一种利用PCR-ELISA方法检测PCV-2的特异性引物对，所述特异性引物对的核苷酸序列如下：

上游引物：5’-GCGGTGGACATGATGAGATT-3’；SEQ ID NO.1；

下游引物：5’-GTTATGGTATGGCGGGAGG-3’；SEQ ID NO.2；

其上游引物5’端利用地高辛标记，下游引物5’端利用生物素标记。

一种利用PCR-ELISA以非诊断治疗为目的检测PCV-2的方法，包括以下步骤：

S1：PCV-2基因的PCR扩增：

S11：提取样品DNA，得到扩增模板DNA；

S12：使用上述特异性引物对进行PCR反应，特异性扩增步骤S11得到的模板DNA；

S2：ELISA检测分析：

S21：用链霉亲和素包被酶标板；

S22：将步骤S1的扩增产物与稀释液按照1：8-10的体积比进行混合后，加入到S21制得的酶标板中，37℃温浴30min；

S23：温育结束后，吸出酶标板中的液体，加入漂洗液对其进行洗涤，每次洗完后甩干，重复3次，之后加入浓度为0.20μl/ml的抗地高辛抗体，35-40℃孵育50-70min；

S24：孵育结束后，吸出酶标板中的液体，加入漂洗液对其进行洗涤，每次洗完后甩干，重复5次，之后加入显色剂，避光反应5-10min；