[发明专利]一种利用PCR-ELISA检测PRRSV的方法

权利要求书

1.一种利用PCR-ELISA方法检测PRRSV的特异性引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如下：

F：5’-GACTGTGGCAGCCCGATTT-3’；SEQ ID NO.1；

R：5’-TGCCGCCGGATTCGCTTCT-3’；SEQ ID NO.2；

所述上游引物5’端利用地高辛标记，所述下游引物5’端利用生物素标记。

2.一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA方法检测PRRSV的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取样品RNA，反转录成cDNA得到扩增模板；

(2)利用权利要求1所述特异性引物对，进行PCR反应，特异性扩增步骤(1)中的模板cDNA；

(3)将步骤(2)中的扩增产物进行ELISA检测分析，包括以下步骤：

a分别利用链霉亲和素和BSA包被酶标板；

b将步骤(2)中的扩增产物与稀释液按照1：9的体积比进行混合后，加入到步骤a中的所述酶标板中，37℃温育30min；

c步骤b所述温育结束后，吸出所述酶标板中的液体，加入漂洗液对其进行洗涤，后在所述酶标板中加入浓度为0.20μl/ml的抗地高辛抗体，37℃孵育30min；

d步骤c所述孵育结束后，吸出所述酶标板中的液体，加入漂洗液对所述酶标板进行洗涤，后在所述酶标板中加入显色剂，避光显色5min；

e步骤d所述显色结束后，向所述酶标板中加入终止液，后在450nm下的检测吸光值。

3.如权利要求2所述一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA方法检测PRRSV的方法，其特征在于，步骤(2)PCR扩增体系为50μl，具体为模板cDNA溶液1μl、上下游引物各1μl、ExTaq DNA聚合酶0.5μl、dNTP为2μl、10xbuffer5μL、灭菌去离子水为39.5μl。

4.如权利要求3所述一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA方法检测PRRSV的方法，其特征在于，所述PCR扩增条件为，96℃，4min；98℃变性10s；54.8℃退火30s；72℃延伸25s，30个循环，72℃，10min。

5.如权利要求2所述一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA方法检测PRRSV的方法，其特征在于，步骤(3)a中利用所述链霉亲和素和BSA包被酶标板的具体方法为：向酶标板孔中加入2.5μg/ml的链霉亲和素溶液100μl，37℃温育30min。

6.如权利要求2所述一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA方法检测PRRSV的方法，其特征在于，步骤(3)a中利用所述BSA包被酶标板的具体方法为：向酶标板孔中加入200μl质量百分数为2％的BSA，37℃温育30min。

7.如权利要求2所述一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA方法检测PRRSV的方法，其特征在于，所述稀释液为PBS缓冲液。

8.如权利要求2所述一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA方法检测PRRSV的方法，其特征在于，所述漂洗液为PBST，所述PBST为0.5％Tween20的PBS缓冲液。

9.如权利要求2所述一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA方法检测PRRSV的方法，其特征在于，所述显色剂为TMB溶液。

10.如权利要求2所述一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA方法检测PRRSV的方法，其特征在于，所述终止液为2M的硫酸溶液。