[发明专利]一种利用PCR-ELISA检测PRRSV的方法

说明书

本发明公开了一种利用PCR‑ELISA检测PRRSV的方法，具体包括：提取样品RNA，反转录成cDNA得到扩增模板；利用特异性引物对，进行PCR反应，特异性扩增模板cDNA；将扩增产物进行ELISA检测分析。本发明提供了一种以非诊断治疗为目的利用PCR‑ELISA检测PRRSV的方法，有效地将PCR和ELISA方法结合，对PRRSV进行检测，具有特异性强、灵敏度高并且检测方法操作简单、快速等优点。

技术领域

本发明涉及分子生物学检测领域，特别是涉及一种利用PCR-ELISA检测PRRSV的方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)引起的以母猪繁殖障碍、仔猪呼吸道症状以及断奶仔猪高死亡率为特征的病毒性传染病。PRRSV感染能够通过多种途径进行传播，造成不同程度的感染发病，并且PRRSV容易发生抗原变异引起毒性加强，是严重影响规模化养猪业发展和智能化清洁生产的一种重要病毒，主要以环境中的空气、饲料、饮水、器具、粪便等作为媒介进行传播。PRRSV常规的诊断方法是琼扩，这种方法虽操作简单，但比较耗时，敏感性低；近年来发展起来的分子和免疫学诊断方法主要是PCR技术和ELISA技术，PCR检测技术具有高的敏感性，但易出现假阳性结果，且结果需要进行电泳判定，需要接触有毒性的EB染料而具有局限性；荧光定量PCR技术也因其敏感性高、特异性强而得到广泛认可，但设备昂贵、成本高与荧光探针保存时间较短等限制了该方法的推广；ELISA方法操作简单，不需要昂贵的仪器，适合大规模流行病学调查，但需要制备高特异性抗体，且敏感度较低。这些方法均不能满足临床对PRRSV准确、经济、稳定的检测需求。

因此，提供一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA检测PRRSV的方法，达到对PRRSV检测特异性强、灵敏度高并且检测方法操作简单、快速的目的是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA检测PRRSV的方法，有效地将PCR和ELISA方法结合，对PRRSV进行检测，具有特异性强、灵敏度高并且检测方法操作简单、快速、成本低可以进行高通量的样品检测等优点。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

根据Genbank:AY150312.1PRRSV基因高保守区序列，设计一种利用PCR-ELISA方法检测PRRSV的特异性引物对，所述引物对的核苷酸序列如下：

F：5’-GACTGTGGCAGCCCGATTT-3’；SEQ ID NO.1；

R：5’-TGCCGCCGGATTCGCTTCT-3’；SEQ ID NO.2；

所述上游引物5’端利用地高辛标记，所述下游引物5’端利用生物素标记。

进一步的，一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA方法检测PRRSV的方法，包括以下步骤：

(1)提取样品RNA，反转录成cDNA得到扩增模板；

(2)利用特异性引物对，进行PCR反应，特异性扩增步骤(1)中的模板cDNA；

(3)将步骤(2)中的扩增产物进行ELISA检测分析，包括以下步骤：

a分别利用链霉亲和素和BSA包被酶标板；

b将步骤(2)中的扩增产物与稀释液按照1：9的体积比进行混合后，加入到步骤a中的所述酶标板中，37℃温育30min；