[发明专利]一种海洋细菌来源新型耐碱耐有机溶剂酯酶及应用

说明书

本发明涉及一种海洋细菌来源新型耐碱和有机溶剂羧酸酯酶Eij5及其编码基因与应用。羧酸酯酶Eij5编码基因来自Erythrobacter jejuensis KCTC23090^T，所涉及酯酶基因经异源表达后，底物为对硝基苯酚丁酸酯(C4)时表现出最高催化活性，催化水解pH值范围为6.5‑10.5，催化水解温度范围为25‑55℃，能耐受多种有机溶剂和金属离子。该酯酶具有耐盐碱耐有机溶剂的特性，可应用于食品加工，手性药物合成和含盐碱、含有机溶剂条件下的环境修复和工业生产。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种海洋细菌来源新型耐碱和有机溶剂酯酶、其编码基因及其应用。

背景技术

酯酶(EC 3.1.1.2)是一类能够催化酯健形成和断裂的水解酶，广泛存在于动物、植物和微生物中。微生物酯酶参与酯化，转酯及水解等多种生物化学反应。酯酶所催化的反应具有反应条件温和、反应效率高、副产物少、不需要辅酶等优点，且水解具有极强的区域专一性和立体特异性，因此，酯酶广泛地应用于食品加工、精细化工、生物医学、手性药物及环境治理等各个领域。

深海是一个天然的微生物资源宝库，深海来源酯酶通常具有与环境相关的优良性质，例如热稳定、耐盐、耐碱、耐低温等，从海洋微生物中筛选具有独特性质的酯酶已成为开发新型工业用酶的一个重要方向。近年来，随着测序技术的发展，许多新发现的细菌类群得以被全基因组测序，通过生物信息学分析对基因组注释后，对注释的蛋白进行序列筛选并结合功能筛选，可筛选出一些具有独特生化性质的新酶基因。

本发明从一种深海细菌中筛选到一种新型耐碱和有机溶剂酯酶基因，并对该基因进行了重组表达，重组酶具有耐盐碱、耐金属离子、耐有机溶剂和去垢剂等特点，可应用于食品加工，手性药物合成和含盐碱、含有机溶剂条件下的环境修复和工业生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的海洋细菌来源水解酶、其编码基因及其制备方法，该水解酶可用于高温高盐条件下酯类降解及其他酯类化合物的生物催化和转化。

本发明涉及一种具有水解酶活性的分离的多肽，其选自下组：

(a)多肽，其与SEQ ID NO:2的多肽所示序列一致；或

(b)多肽，其为SEQ ID NO:2所示多肽的远离催化中心位置进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸得到的突变体，该突变体具有与SEQ ID NO:2所示的蛋白序列至少90％以上的同源性及至少90％以上的水解酶活性。

本发明所述的具有水解酶活性的多肽，其来源于一种能表达耐盐碱和有机溶剂酯酶的菌株Erythrobacter jejuensis KCTC23090^T，该细菌分离自韩国济州岛海滨海水，分类命名为Erythrobacter jejuensis，自韩国大田KCTC菌种库购买。

基于全基因组序列分析筛选从Erythrobacter jejuensis KCTC23090获得水解酶基因Eij5，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。基因Eij5大小为951bp，碱基组成为165 A(17.35％)、175 T(18.40％)、321 C(33.75％)和290 G(30.49％)，编码蛋白大小为316个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。将该水解酶Eij5氨基酸序列在GenBank数据库中进行同源搜索，与之一致性最高的是不同属细菌Erythrobacter litoralisHTCC2594^T中的酯酶，一致性为83％(其在GenBank数据库中的注册号为WP_011414343.1)。氨基酸序列分析结果表明，活性位点丝氨酸位于具有甘氨酸-X-丝氨酸-X-甘氨酸特征的保守序列内(氨基酸位置为161-166)，与255位天冬氨酸，285位组氨酸共同构成酯酶的催化中心，89-92位氨基酸构成组氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸序列为第IV家族酯酶保守特征序列，综上所述，Eij5为酯类水解酶第IV家族中新成员。