[发明专利]一种肝癌细胞侵袭转移的分子机制研究方法

权利要求书

1.一种肝癌细胞侵袭转移的分子机制研究方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、收集人肝癌细胞SMMC-7721和MHCC-97H、人正常肝细胞WRL-68以及肝星状细胞HSC、血管内皮细胞ECV304，提取总RNA，利用real-timePCR技术检测多种MicroRNAs的表达，并将癌细胞中表达量与正常细胞比较，筛选出一组特异MicroRNAs：miR-21、miR-26a、miR-199a-3p、miR-122、miR-151、miR-221；

S2、根据筛选出的特异MicroRNAs序列，构建其干预载体，转染SMMC-7721、MHCC-97H、WRL-68、HSC、ECV304，转染48h后，收集细胞及上清，提取总RNA，利用real-timePCR技术检测转染后不同细胞系miR-21、miR-26a、miR-199a-3p、miR-122、miR-151、miR-221的表达，确定所构建载体的有效性，同时比较转染后各MicroRNA在胞内和上清中含量的变化；

S3、将特异MicroRNAs干预载体、PTEN干预载体分别转染HSC和ECV304，转染48h后收集细胞，WesternBlot和免疫荧光标记检测PTEN/PI3K/AKT、EGFR、VEGFR、Ras/ERK和STATs等信号的表达和定位；MTT和wound-healing实验观察细胞的增殖、迁移能力的变化；

S4、将特异MicroRNAs干预载体、PTEN干预载体分别转染SMMC-7721和MHCC-97H，48h后收集细胞，WesternBlot和免疫荧光标记检测PTEN/PI3K/AKT、EGFR、VEGFR、Ras/ERK和STATs等信号的表达和定位；MTT和wound-healing实验观察细胞的增殖、迁移能力的变化；WesternBlot和免疫荧光标记检测EMT指标，包括上皮细胞表型指标和间质细胞表型指标；

S5、用特异MicroRNAs的干预载体转染SMMC-7721和MHCC-97H，48h后收集其上清，用于培养HSC和ECV304；继续培养48h后收集HSC和ECV304细胞，WesternBlot和免疫荧光标记检测PTEN/PI3K/AKT、EGFR、VEGFR、Ras/ERK和STATs等信号的表达和定位；MTT和wound-healing实验观察细胞的增殖、迁移能力的变化；

S6、用特异MicroRNAs的干预载体转染SMMC-7721和MHCC-97H，与HSC和ECV304在transwell板中一起培养；继续培养48h后收集HSC和ECV304细胞，WesternBlot和免疫荧光标记检测PTEN/PI3K/AKT、EGFR、VEGFR、Ras/ERK和STATs等信号的表达和定位；MTT和wound-healing实验观察细胞的增殖、迁移能力的变化；

S7、收集肝癌骨转移临床标本，采用qRT-PCR、免疫荧光、免疫组化方法检测MicroRNAs、信号蛋白分子的表达，分析验证肝癌骨转移组织中癌细胞和间质细胞的形态、表型特征、间质血管密度及其与MicroRNAs相关性；

S8、将肝癌细胞MHCC-97H皮下注射入腹腔和肝内，模拟癌转移，建立小鼠肝癌转移模型；以携带miR-21反义序列和PTEN过表达腺病毒载体，通过裸鼠腹腔和肝内注射，干预癌细胞和间质细胞MicroRNAs及其下游靶基因表达；通过小动物活体成像技术观察肿瘤结节的分布、大小、数量及转移情况；取肿瘤结节或转移灶，采用realtime-PCR、WesternBlot、免疫荧光、免疫组化等方法，检测癌细胞和间质细胞MicroRNAs、信号蛋白分子的表达；CD31抗体标记间质血管，计数间质微血管数量，观察干预MicroRNAs表达及抑制信号通路活性是否对肿瘤细胞生长、侵袭、转移产生抑制作用。

2.根据权利要求1所述的一种肝癌细胞侵袭转移的分子机制研究方法，其特征在于，所述S2-S6中，干预载体包括过表达和封闭表达载体。

3.根据权利要求1所述的一种肝癌细胞侵袭转移的分子机制研究方法，其特征在于，所述S4中，上皮细胞表型指标包括E-钙黏蛋白、黏蛋白、角蛋白和桥粒斑蛋白，间质细胞表型指标包括波形蛋白、N-钙黏蛋白和纤连蛋白。

4.根据权利要求1所述的一种肝癌细胞侵袭转移的分子机制研究方法，其特征在于，所述S1中，肝星状细胞HSC的分离是利用胶原酶消化的方法对肝癌癌旁组织标本内的活化HSC进行分离和纯化。