[发明专利]一种肝癌细胞侵袭转移的分子机制研究方法

说明书

本发明公开了一种肝癌细胞侵袭转移的分子机制研究方法，包括以下步骤：收集人肝癌细胞SMMC‑7721和MHCC‑97H、人正常肝细胞WRL‑68以及肝星状细胞HSC、血管内皮细胞ECV304，提取总RNA，利用real‑timePCR技术检测多种MicroRNAs的表达，并将癌细胞中表达量与正常细胞比较，筛选出一组特异MicroRNAs；根据筛选出的特异MicroRNAs序列，构建其干预载体，转染SMMC‑7721、MHCC‑97H、WRL‑68、HSC、ECV304。提出肝癌转移发生的新观点，有助于筛选针对miRNAs靶基因的干预性治疗策略，防治肝癌侵袭、转移和复发。

技术领域

本发明涉及细胞治疗技术领域，具体为一种肝癌细胞侵袭转移的分子机制研究方法。

背景技术

肝癌是威胁人类生命安全的常见肿瘤，癌细胞的侵袭转移和复发是影响患者预后的主要因素。深入研究癌细胞侵袭转移的分子机制，筛选有效的分子靶点抑制肝癌的复发转移，对提高肝癌临床疗效改善患者预后具有重要意义。肝癌转移即可发生于肝内，也可发生于肝外，其分子机制可能与癌细胞特性、间质细胞特性及细胞外基质的改变密切相关。癌细胞、间质细胞、细胞外基质三者共同构筑转移微环境，促进癌细胞在转移部位的停留生长。但是，关于癌细胞侵袭转移的机制依然还存在着许多问题有待解决。

癌细胞侵袭转移与间质微环境密切相关。前期研究发现，肝星状细胞(HSC)在肝癌肝内转移中起关键作用，癌细胞迁徙到新部位并向细胞外基质分泌miR-21，作为癌细胞与HSC间信使，将生长信号传递到HSC内，灭活HSC的PTEN，促使HSC激活，一起构筑转移微环境，促进癌细胞转移生长。但癌侵袭转移机制十分复杂，涉及更多MicroRNAs和信号途径，且癌相关间质细胞(CIC)来源也不止一种。所以有必要研究肝癌细胞活化CIC构筑转移微环境及其调控癌细胞转移的机制，为筛选肝癌转移的分子靶标并建立靶向干预策略奠定基础。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种肝癌细胞侵袭转移的分子机制研究方法，具备为筛选肝癌转移的分子靶标并建立靶向干预策略奠定了基础和有望开发相关试剂盒并应用于临床等优点，解决了目前在癌症治疗方面无法应对的问题。

(二)技术方案

为实现上述为筛选肝癌转移的分子靶标并建立靶向干预策略奠定了基础和有望开发相关试剂盒并应用于临床的目的，本发明提供如下技术方案：一种肝癌细胞侵袭转移的分子机制研究方法，包括以下步骤：

S1、收集人肝癌细胞SMMC-7721和MHCC-97H、人正常肝细胞WRL-68以及肝星状细胞HSC、血管内皮细胞ECV304，提取总RNA，利用real-timePCR技术检测多种MicroRNAs的表达，并将癌细胞中表达量与正常细胞比较，筛选出一组特异MicroRNAs：miR-21、miR-26a、miR-199a-3p、miR-122、miR-151、miR-221；

S2、根据筛选出的特异MicroRNAs序列，构建其干预载体，转染SMMC-7721、MHCC-97H、WRL-68、HSC、ECV304，转染48h后，收集细胞及上清，提取总RNA，利用real-timePCR技术检测转染后不同细胞系miR-21、miR-26a、miR-199a-3p、miR-122、miR-151、miR-221的表达，确定所构建载体的有效性，同时比较转染后各MicroRNA在胞内和上清中含量的变化；

S3、将特异MicroRNAs干预载体、PTEN干预载体分别转染HSC和ECV304，转染48h后收集细胞，WesternBlot和免疫荧光标记检测PTEN/PI3K/AKT、EGFR、VEGFR、Ras/ERK和STATs等信号的表达和定位；MTT和wound-healing实验观察细胞的增殖、迁移能力的变化；