[发明专利]一种戊型肝炎病毒的培养方法及其灭活疫苗的制备方法

权利要求书

1.一种基因4型戊型肝炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(a)在含有2-10％胎牛血清的DMEM培养基中培养Vero细胞，使细胞浓度达到10⁶-10⁷/mL；

(b)将戊型肝炎病毒接种到上述细胞浓度的细胞基质培养基中，35.5-37.5℃孵育2-3h，后补加含有2％胎牛血清的DMEM培养基，置35.5-37.5℃培养；所述的戊型肝炎病毒核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

(c)将步骤（b）培养后的细胞于-60℃至-80℃反复冻融3-5次，获得病毒-细胞培养悬液；

(d)经浓缩纯化、灭活后获得戊型肝炎灭活疫苗。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述DMEM培养基pH为6.8-7.4。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Vero细胞为自液氮容器内取出经1000rmp离心10min，弃去原保存液后得到的Vero细胞。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(d)的具体过程是如下：用10％PEG和0.4M的NaCl溶液浓缩，10000rpm离心60min，弃上清，收集沉淀；将收集的沉淀用10μmol/L PBS悬浮后，12000rmp离心30min，弃沉淀，收集上清；经1.5g/mL氯化铯38000rpm梯度离心5h，弃上清，收集沉淀；将收集的沉淀用10μmol/L PBS悬浮，之后柱层析进一步去除残余DNA和杂蛋白，得到的病毒用250μg/ml的甲醛37℃灭活15天，每毫升病毒加0.5mg氢氧化铝佐剂和5μg苯氧乙醇防腐剂，得到戊型肝炎灭活疫苗。