[发明专利]一种戊型肝炎病毒的培养方法及其灭活疫苗的制备方法

说明书

本发明公开了一种戊型肝炎病毒的培养方法，同时还公布了其灭活疫苗制备方法。该病毒可以在Vero细胞上稳定增殖且动物实验已经证实该病毒株具有良好的免疫原性，可以用作生产疫苗的毒种。用该病毒生产戊型肝炎灭活疫苗不仅在安全性方面更可靠，而且具有良好的免疫原性和保护效果，是生产戊型肝炎灭活疫苗的理想毒株。

技术领域

本发明涉及肝炎病毒技术领域，尤其涉及戊型肝炎病毒的培养方法及其灭活疫苗的制备方法。

背景技术

戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus，HEV)，是一种经粪口途径传播，严重危害人类健康的病毒性肝炎病原体。目前，全世界已有约三分之一的人口感染HEV，其中孕妇感染HEV后死亡率高达20％-25％。2015年WHO报道显示，仅亚洲和非洲的9个地区就有近2010万人感染HEV，每年死亡人数到达30万，其中7万人死于HEV感染所引发的重症肝炎，并造成5200胎儿死亡。中国是戊肝高发地区之一，其中1986年在新疆大规模爆发，导致119280例感染，死亡707例。2013年全国重点传染病疫情分析报告表明，病毒性肝炎仍占据甲乙类传染病中发病率的首位，其中HEV名列传染病致死率的前10位，成为我国急性流行性肝炎中的最大杀手。

近年大量临床报道发现戊肝感染可导致慢性化，并在短期内造成肝硬化。更严重的是，戊肝已经证实是一种人畜共患病，生吃猪肉、猪肝，或饮用生牛奶都会导致人类感染HEV，极大的增加了HEV感染的风险。因此，迫切需要对HEV疫苗进行深入的研发。

目前戊肝病毒没有有效的治疗方法。由于HEV缺乏有效的细胞培养体系，阻碍了传统全病毒疫苗的研究。尽管2012年厦门大学针对HEV基因1研制出世界上首支HEV基因工程疫苗“益可宁”，但与我国主要流行基因4型存在一定的差异，并且目前市面上仍无商品化的疫苗出售。此外，由于该重组疫苗只表达HEV基因1型的部分衣壳蛋白，因此其对我国主要流行的基因4型的保护性还有待进一步的评价。而传统的全病毒疫苗不仅保留了病毒刺激机体免疫系统的特性，并且是以完整的病原体作为抗原，具有所有新型基因重组疫苗所不可替代的优势。因此，在HEV可培养的基础上，传统的全病毒疫苗将会是预防HEV最好的策略。

发明内容

为了解决上述技术问题提，本发明提供一种制备戊型肝炎灭活疫苗的新的戊型肝炎病毒(命名为KM01)的培养方法，该毒株可以在Vero细胞上稳定增殖，且动物实验已经证实KM01具有良好的免疫原性，可以用作生产疫苗的毒种。用该病毒KM01生产戊型肝炎灭活疫苗不仅在安全性方面更可靠，而且具有良好的免疫原性和保护效果，此毒株是生产戊型肝炎灭活疫苗的理想毒株。还提供了利用该病毒制备灭活疫苗的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种戊型肝炎病毒的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

(a)从戊型肝炎急性感染猪粪便中分离得到病毒，经生物学特性鉴定确认为戊型肝炎病毒；其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

(b)在Vero细胞上盲传适应6代，并仍具有较高的病毒滴度(10⁷)；

(c)在Vero上培养适应过程中逐渐减少培养时间，早代次培养周期为23天，传至10代后病毒繁殖周期由23天缩短到7天；其中，每次培养期满后，将细胞于-80℃反复冻融3次，获得病毒-细胞培养悬液，置-80℃保存备用；

(d)通过蚀斑纯化，获得3株较为单一的HEV克隆株，经PCR和透射电镜鉴定为HEV病毒颗粒，在前6代核苷酸序列中未发现有义氨基酸突变，遗传稳定性较好；

(e)排除HEV阳性的克隆中其他肠道病毒群的感染；

(f)最终获得一株所需的戊型肝炎病毒，该病毒于-80℃保藏，命名为KM01。

一种戊型肝炎灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：