[发明专利]一种利用基因组碱基编辑器系统生产FGF5基因编辑山羊的方法在审
| 申请号： | 201910234408.8 | 申请日： | 2019-03-26 |
| 公开（公告）号： | CN109929878A | 公开（公告）日： | 2019-06-25 |
| 发明（设计）人： | 王小龙;李冠纬;周世卫;蔡蓓;陈玉林 | 申请（专利权）人： | 西北农林科技大学 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N15/90;A01K67/027 |
| 代理公司： | 北京久维律师事务所 11582 | 代理人： | 邢江峰 |
| 地址： | 712000 陕*** | 国省代码： | 陕西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 山羊 体外转录载体 第一外显子 体外转录 系统生产 编辑器 基因组 碱基 基因 输卵管 细胞质 山羊受精卵 特异性靶向 基因敲除 体外培养 靶向 构建 后移 植入 蛋白 注射 生产 | ||
1.一种利用基因组碱基编辑器系统生产FGF5基因编辑山羊的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.构建特异性靶向FGF5第一外显子的sgRNA的体外转录载体；通过体外转录得到靶向FGF5第一外显子的sgRNA；
S2.体外转录BE3蛋白的体外转录载体，得到BE3 mRNA；
S3.将以上步骤的sgRNA及BE3 mRNA，纯化后混合，注射入山羊受精卵细胞质中，经体外培养后移植入同种雌性山羊输卵管中，用于生产FGF5基因敲除的基因编辑山羊。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中的sgRNA的体外转录载体为pUC57-T7-sgRNA载体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述sgRNA的体外转录载体pUC57-T7-sgRNA通过以下方法制备得到：
(1)设计并合成识别FGF5基因第一外显子的sgRNA；
(2)合成后的sgRNA寡核苷酸进行体外退火；
(3)将sgRNA通过BsaI位点进行酶切、连接，插入到pUC57-T7-gRNA中，命名为pUC57-T7-sgRNA。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中退火体系为100uM Up Oligo4.5ul，100uM Down Oligo4.5ul，NEB buffer Ⅱ 1ul；在PCR仪中按照以下退火程序运行：95℃，5min；95-85℃at-2℃/s；85-25℃at-0.1℃/s；保持在4℃。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中酶切体系为：3ug pUC57-T7-sgRNA；5ul CutSmart Buffer；1.5ul BsaI三种体系混合好，补水至50ul，37℃孵育8小时，用AxyPrep PCR Cleanup Kit纯化，回收至30ul灭菌水中。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中的BE3蛋白的体外转录载体为pCMV-BE3。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S3中sgRNA、BE3 mRNA混合后，终浓度为BE3 mRNA 25ng/μL，sgRNA 10ng/μL。
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