[发明专利]一种利用基因组碱基编辑器系统生产FGF5基因编辑山羊的方法

说明书

本发明公开了一种利用基因组碱基编辑器系统生产FGF5基因编辑山羊的方法，该方法包括以下步骤：构建特异性靶向FGF5第一外显子的sgRNA的体外转录载体；通过体外转录得到靶向FGF5第一外显子的sgRNA；体外转录BE3蛋白的体外转录载体，得到BE3 mRNA；将以上步骤的sgRNA及BE3 mRNA，纯化后混合，注射入山羊受精卵细胞质中，经体外培养后移植入同种雌性山羊输卵管中，用于生产FGF5基因敲除的基因编辑山羊。

技术领域

本发明属于动物基因工程和遗传修饰技术领域，具体地说，涉及一种利用基因组碱基编辑器系统生产FGF5基因编辑山羊的方法。

背景技术

CRISPR/Cas9系统介导的的基因编辑技术广泛应用于许多生物的基因组中，用于遗传修饰，范围涉及到了生物，医学，农业等多个领域，构建出了多种大型动物模型。

单核苷酸多态性(SNP)是人类以及动物中最常见的遗传变异类型。据文献报道，很多单碱基突变与人类疾病与生产性状相关。目前，已经有了简单的碱基编辑系统(BE)，在不产生双链断裂的情况下诱导C向T或G向A转变。最新的报告称，BE3(rAPOBEC1-nCas9-UGI)的碱基编辑效率优于BE1(rAPOBEC1-dCas9)和BE2(rAPOBEC1-dCas9-UGI)。

FGF5基因是毛发生长周期中的信号分泌蛋白，影响毛囊周期性活动及被毛生长的重要的生长因子。FGF5基因通过阻断真皮毛乳头细胞的增殖使毛囊发育进入退行期从而抑制毛发生长。敲除FGF5基因山羊的羊绒生长比野生型明显加快。同时也首次证明了基因组碱基编辑器在大型动物上的可行性，可以应用于生物医学和食品工程中构建大型动物模型。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种利用基因组碱基编辑器系统生产FGF5基因编辑山羊的方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种利用基因组碱基编辑器系统生产FGF5基因编辑山羊的方法，包括以下步骤：

S1.构建特异性靶向FGF5第一外显子的sgRNA的体外转录载体；通过体外转录得到靶向FGF5第一外显子的sgRNA；

S2.体外转录BE3蛋白的体外转录载体，得到BE3mRNA；

S3.将以上步骤的sgRNA及BE3mRNA，纯化后混合，注射入山羊受精卵细胞质中，经体外培养后移植入同种雌性山羊输卵管中，用于生产FGF5基因敲除的基因编辑山羊。

可选地，所述步骤S1中的sgRNA的体外转录载体为pUC57-T7-sgRNA载体。

可选地，所述sgRNA的体外转录载体pUC57-T7-sgRNA通过以下方法制备得到：

(1)设计并合成识别FGF5基因第一外显子的sgRNA；

(2)合成后的sgRNA寡核苷酸进行体外退火；

(3)将sgRNA通过BsaI位点进行酶切、连接，插入到pUC57-T7-gRNA中，命名为pUC57-T7-sgRNA。

可选地，步骤(2)中退火体系为100uM Up Oligo 4.5ul，100uM Down Oligo4.5ul，NEB bufferⅡ1ul；在PCR仪中按照以下退火程序运行：95℃，5min；95-85℃at-2℃/s；85-25℃at-0.1℃/s；保持在4℃。

可选地，步骤(3)中酶切体系为：3ugpUC57-T7-sgRNA；5ul CutSmart Buffer；1.5ul BsaI三种体系混合好，补水至50ul，37℃孵育8小时，用AxyPrep PCR Cleanup Kit纯化，回收至30ul灭菌水中。

可选地，所述步骤S2中的BE3蛋白的体外转录载体为pCMV-BE3。