[发明专利]一种鼠单克隆抗体功能轻链可变区基因的扩增方法

说明书

本发明涉及一种鼠单克隆抗体轻链可变区基因的扩增方法，根据内源性非功能轻链CDR3区特异性引物进行第一轮反转录，反应结束后使用RNase H降解RNA‑cDNA嵌合体中的RNA。再以上述第一轮反转录产物使用恒定区特异引物进行第二轮反转录，反应产物同样使用RNase H处理，获得含有功能轻链转录本的cDNA。最后用前导区及恒定区引物对第二轮反转录制备的cDNA进行PCR扩增，即获得功能性轻链可变区基因。本发明提供了简单、快速、高效的从杂交瘤细胞中扩增鼠单克隆抗体轻链可变区序列的方法。本发明降低杂交瘤细胞cDNA中完整的内源性非功能轻链可变区反转录产物含量，增加终产物中功能性轻链可变区比例。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及从杂交瘤中扩增鼠单克隆抗体功能轻链可变区基因的方法。

背景技术

单克隆抗体广泛用于生物医学领域，在多种疾病的诊断、临床治疗中发挥重要作用。杂交瘤细胞技术是单克隆抗体研发最重要的技术手段之一，而从筛选获得的杂交瘤基因组扩增功能抗体基因更是为后续重组抗体开发及人源化改造奠定基础。多项研究报道用于杂交瘤融合的Sp2/0细胞中含有大量内源性非功能轻链序列，这些序列由于多种原因不能有效翻译成蛋白质，但干扰从杂交瘤中扩增功能性轻链序列。目前，多种策略被用于从杂交瘤细胞中扩增轻链抗体基因，其中最常用是采用限制性内切酶方法去除内源性非功能基因，但操作复杂并且效率不高。

因此，亟需一种简单高效的扩增方法能够快速从杂交瘤细胞中扩增鼠单克隆抗体轻链可变区序列。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速、简单、高效的鼠单克隆抗体功能轻链可变区基因的扩增方法。

本发明的技术方案是：鼠单克隆抗体轻链可变区扩增方法，包括以下步骤：

⑴杂交瘤细胞总RNA提取；

⑵第一轮反转录反应制备cDNA：

在第一轮反转录反应中，使用内源性非功能轻链CDR3区特异性引物进行反转录，反应结束后使用RNase H对反应产物中RNA-DNA嵌合体的RNA链进行降解，以去除RNA模板中内源性非功能轻链可变区转录本；

⑶第二轮反转录反应制备cDNA：

在第二轮反转录反应中，以第一轮产物为模板，以鼠单克隆抗体轻链恒定区特异性引物进行反转录，反应结束后使用RNase H降解RNA-DNA嵌合体的RNA链；

⑷鼠单克隆抗体轻链可变区扩增：

最后使用前导区及恒定区引物进行PCR扩增功能轻链可变区序列。

其中在上述第一轮反转录反应中引物设计模板内源性非功能轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

其中在上述第一轮反转录反应中使用的内源性非功能轻链CDR3区特异性引物核苷酸序列P1为acctattactgtcagcacatta。

其中在上述第二轮反转录反应中引物设计模板鼠单克隆抗体轻链恒定区核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

其中在上述第二轮反转录反应中使用的鼠单克隆抗体轻链恒定区特异性引物核苷酸序列P2为ggatacagttggtgcagcatc。

其中在上述PCR扩增轻链可变区序列使用前导区引物序列P1为acctattactgtcagcacatta和P3为gayattgtgmtsacmcarwct。

本发明提供了简单、快速、高效的从杂交瘤细胞中扩增鼠单克隆抗体轻链可变区序列的方法。

本发明采用两轮反转录法降低杂交瘤细胞cDNA中完整的内源性非功能轻链可变区反转录产物含量，增加终产物中功能性轻链可变区比例。