[发明专利]一种血液样本中胰岛素类似物的检测方法

权利要求书

1.一种血液样本中胰岛素类似物的检测方法，其特征在于：采用液相-质谱联用系统对胰岛素类似物进行分析；检测方法包括以下步骤：

步骤一：确定LC-MS/MS条件：

LC条件如下：

流动相：流动相A：含质量比0.1％乙酸的乙腈；流动相B：含质量比0.1％乙酸的水；

梯度洗脱条件包括如下三个阶段：

第一阶段：起始流动相体积比：A:B＝90:10；

第二阶段：流动相体积比：A:B＝52:48；

第三阶段：流动相体积比：A:B＝5:95；

第四阶段：流动相体积比：A:B＝90:10至结束；

且第一阶段和第三阶段的洗脱时间之和大于或等于1.5min；

流速：0.25mL/min；

进样量：10μL；

MS条件如下：

检测方式：多反应监测MRM；

扫描方式：正离子扫描；

离子喷雾电压：5500V；

离子喷雾电压：5500V；

气帘气：35；

雾化气：55；

辅助气：50；

离子源温度：250℃；

碰撞气种类：N₂；

碰撞气压力：High

步骤二：绘制标准曲线：

将胰岛素类似物溶于甲醇中，稀释制成胰岛素类似物浓度为1.7ppb-3400ppb的标准溶液，再加入大鼠血浆样本中，制成胰岛素类似物浓度为0.17ppb～340ppb的标准曲线样品；

将标准曲线样品通过前处理后，以所述LC-MS/MS条件分别检测标准曲线样品，并根据检测结果绘制胰岛素类似物的标准曲线；

步骤三：样品检测：

将待测血液样本通过前处理后，以所述LC-MS/MS条件进行检测，并将检测结果与所述标准曲线对照，计算出待测血液样本中胰岛素类似物的含量；

步骤二中标准曲线样品的前处理包括如下步骤：取45ul动物血浆加入5ul胰岛素类似物标准曲线样品溶液，涡旋10s,然后加入100ul甲醇沉淀蛋白，涡旋2min,低温高速离心10min，取上清；

步骤三中待测血液样品的前处理包括如下步骤：取45ul动物血浆加入5ul待测血液样本溶液，涡旋10s,然后加入100ul甲醇沉淀蛋白，涡旋2min,低温高速离心10min，取上清。

2.根据权利要求1所述的血液样本中胰岛素类似物的检测方法，其特征在于：步骤一中所述的LC条件中，使用的高效液相色谱仪的型号为Agilent1100、Agilent1200、Agilent1260、Agilent1290、岛津LC-20A和岛津LC-30A中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的血液样本中胰岛素类似物的检测方法，其特征在于：步骤一中所述的LC条件中，液相色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18、Agilent ZORBAXEclipse Plus-C18、Agilent ZORBAX SB-C18、Waters SunFire C18、Waters CSH C18、Agela Venusil XBP C18中的任意一种。

4.根据权利要求1所述的血液样本中胰岛素类似物的检测方法，其特征在于：步骤一中所述的LC条件中，梯度洗脱条件为：

起始流动相体积比：A:B＝90:10；

步骤①：0～3.5min，流动相体积比由A:B＝90:10匀速上升至A:B＝52:48；

步骤②：3.5～3.8min，流动相体积比A:B＝52:48；

步骤③：3.8～4.0min，流动相体积比由A:B＝52:48匀速上升至A:B＝5:95；

步骤④：4.0～6.0min，流动相体积比A:B＝5:95；

步骤⑤：6.0～6.1min，流动相体积比由A:B＝5:95匀速下降至A:B＝90:10；

步骤⑥：6.1～8.5min，A:B＝90:10；

其中步骤①和步骤⑥的洗脱时间之和大于4min。

5.根据权利要求1所述的血液样本中胰岛素类似物的检测方法，其特征在于：步骤一中所述的LC条件中，液相色谱柱的柱温为25～35℃。