[发明专利]超低温脱除葡萄卷叶病毒-3方法及用途

权利要求书

1.一种超低温脱除葡萄卷叶病毒-3方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤(1)，取葡萄枝条单茎段，消毒杀菌后，移栽到初代培养基上培养，得到腋芽萌发的茎段；其中，所述初代培养基的基础培养基为MS培养基，且在每升MS培养基添加25-35g蔗糖；所述葡萄枝条为感染有葡萄卷叶病毒-3的葡萄枝条；

步骤(2)，将腋芽萌发的茎段栽种到增殖培养基上培养，取含有5-6片叶原基的茎尖；其中，所述增殖培养基为培养基；

步骤(3)，将含有叶原基的茎尖移栽到预培养基上，黑暗培养；其中，所述预培养基的配方包括0.4M蔗糖、0.2μM谷胱甘肽和0.16μM抗坏血酸；

步骤(4)，将经过步骤(3)中预培养基培养的茎尖在加载液中处理，之后，置于冰上，得到冷冻保护剂滴包裹的茎尖；所述加载液的配方包括2M蔗糖和0.4M甘油；

步骤(5)，将所述冷冻保护剂滴包裹的茎尖放入液氮中，之后转移到卸载液中，进行解冻和卸载；其中，所述卸载液含有1.2M蔗糖；

步骤(6)，将解冻后的茎尖移栽到恢复培养基上进行黑暗培养，得到不带葡萄卷叶病毒-3的茎尖；其中，所述恢复培养基的基础培养基为培养基，且含有0.6M蔗糖。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(6)之后，所述方法还包括：

步骤(7)，将步骤(6)黑暗培养后的茎尖移栽到培养基进行继代培养，并检测继代培养的植株是否带有葡萄卷叶病毒-3。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(6)和步骤(7)之间，所述方法还包括：

步骤(6’)，将步骤(6)黑暗培养后的茎尖移栽到PTM培养基上进行黑暗培养，并观察茎尖的成活率；之后，转移至光照培养，并观察茎尖的再生率；其中，PTM培养基的基础培养基为培养基，且添加有0.5mg/L的苄氨基腺嘌呤。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述检测继代培养的植株是否带有葡萄卷叶病毒-3包括：

提取待检测植株的总RNA；

以植株的总RNA为模板进行反转录合成cDNA；

以cDNA为模板，采用葡萄卷叶病毒-3特异性引物进行PCR扩增，得到PCR产物；

根据所述PCR产物判断待检测植株是否带有葡萄卷叶病毒-3。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所根据所述PCR产物判断待检测植株是否带有葡萄卷叶病毒-3包括：

对所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析；

根据琼脂糖凝胶电泳分析结果判断待检测植株是否带有葡萄卷叶病毒-3。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述葡萄枝条选自以下任一种：

阳光玫瑰葡萄枝条、巨峰葡萄枝条。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(5)中，将所述冷冻保护剂滴包裹的茎尖放入液氮中5min，立即转移到卸载液中，进行解冻和卸载30min。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，将经过步骤(3)中预培养基培养的茎尖在加载液中处理，之后，置于冰上，得到冷冻保护剂滴包裹的茎尖，包括：

将经过步骤(3)中预培养基培养的茎尖在加载液中处理30min，之后，置于冰上50min，得到冷冻保护剂滴包裹的茎尖；

在步骤(5)中，所述将所述冷冻保护剂滴包裹的茎尖放入液氮中，之后转移到卸载液中，进行解冻和卸载，包括：

将冷冻保护剂滴包裹的茎尖转移至铝箔条上，并装入冷冻管中，然后将冷冻管放入液氮中5min。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)，在初代培养基上培养，得到腋芽萌发的茎段的培养条件为：温度为20-24℃、光周期为16h、光照强度为50μmols^-1m^-2。

10.如权利要求1-9任一项所述的超低温脱除葡萄卷叶病毒-3方法在葡萄种植中的用途。