[发明专利]超低温脱除葡萄卷叶病毒-3方法及用途

说明书

本说明书实施例提供了一种超低温脱除葡萄卷叶病毒‑3方法及用途。所述方法包括以下步骤：取葡萄枝条单茎段，消毒杀菌后，继代在初代培养基上培养，将腋芽萌发的茎段继代到增殖培养基上培养，取含有5‑6片叶原基的茎尖栽到预培养基上，黑暗培养；将经过预培养基培养的茎尖在加载液中处理，之后，置于冰上，然后制成小滴；将冷冻保护剂包裹的茎尖放入液氮中，之后转移到卸载液中，进行解冻和卸载；将解冻后的茎尖移栽到恢复培养基上进行黑暗培养，得到不带葡萄卷叶病毒‑3的植株。

技术领域

本说明书一个或多个实施例涉及植物组培技术领域，尤其涉及超低温脱 除葡萄卷叶病毒-3方法及用途。

背景技术

葡萄卷叶病(Grapevine leafroll disease)是一种对葡萄具有严重危害 的的病毒病。会导致葡萄植株长势减弱，根系发育不良，抗逆性减弱，易受 冻害；枝蔓嫁接成活率显著降低，生根能力差。

现已研究表明引起葡萄卷叶病的病毒不止一种，其中葡萄卷叶病毒 -3(GLRaV-3)是最主要的一种。因此，亟需一种可以脱除葡萄卷叶病毒-3的方 案。

发明内容

本说明书一个或多个实施例描述了一种超低温脱除葡萄卷叶病毒-3方法 及用途，可以有效脱除葡萄卷叶病毒-3。

根据第一方面，提供了一种超低温脱除葡萄卷叶病毒-3方法，包括以下 步骤：

步骤(1)，取葡萄枝条单茎段，消毒后，移栽到初代培养基上培养，得 到腋芽萌发的茎段；其中，所述初代培养基的基础培养基为MS培养基，且在 每升MS培养基添加25-35g蔗糖；所述葡萄枝条为感染有葡萄卷叶病毒-3的 葡萄枝条；

步骤(2)，将腋芽萌发的茎段栽种到增殖培养基上培养，得到含有5-6 片叶原基的茎尖；其中，所述增殖培养基为培养基；

步骤(3)，将含有叶原基的茎尖移栽到预培养基上，黑暗培养；其中， 所述预培养基的配方包括0.4M蔗糖、0.2μM谷胱甘肽和0.16μM抗坏血酸；

步骤(4)，将经过步骤(3)中预培养基培养的茎尖在加载液中处理， 之后，置于冰上，得到冷冻保护剂滴包裹的茎尖；所述加载液的配方包括2M 蔗糖和0.4M甘油；

步骤(5)，将所述冷冻保护剂滴包裹的茎尖放入液氮中，之后转移到卸 载液中，进行解冻和卸载；其中，所述卸载液含有1.2M蔗糖；

步骤(6)，将解冻后的茎尖移栽到恢复培养基上进行黑暗培养，得到不 带葡萄卷叶病毒-3的茎尖；其中，所述恢复培养基的基础培养基为培养 基，且含有0.6M蔗糖。

在一个实施例中，在步骤(6)之后，所述方法还包括：

步骤(7)，将步骤(6)黑暗培养后的茎尖移栽到培养基进行继代 培养，并检测继代培养的植株是否带有葡萄卷叶病毒-3。

在一个示例中，在步骤(6)和步骤(7)之间，所述方法还包括：

步骤(6’)，将步骤(6)黑暗培养后的茎尖移栽到PTM培养基上进行 黑暗培养，并观察茎尖的成活率；之后，转移至光照培养，并观察茎尖的再 生率；其中，PTM培养基的基础培养基为培养基，且添加有0.5mg/L的苄 氨基腺嘌呤。

在一个实施例中，所述检测继代培养的植株是否带有葡萄卷叶病毒-3包 括：

提取待检测植株的总RNA；

以植株的总RNA为模板进行反转录合成cDNA；

以cDNA为模板，采用葡萄卷叶病毒-3特异性引物进行PCR扩增，得到 PCR产物；

根据所述PCR产物判断待检测植株是否带有葡萄卷叶病毒-3。