[发明专利]一种基于高通量测序的IGH基因重排检测方法

说明书

本发明涉及一种基于高通量测序的IGH基因重排检测方法，其包括：根据已知的IGH基因序列设计及合成扩增引物，对扩增片段进行多重扩增反应，获得IGH扩增引物；对IGH扩增产物进行纯化，并进行末端修饰；将修饰后的扩增产物与高通量测序平台的接头进行连接并进行连接修复、纯化，得到高通量测序文库；上机测序及数据分析；其中，所述扩增引物包括设计位置分别位于FR1、FR2和FR3区域的正向引物和设计位置位于J区的反向引物。本发明还涉及用于IGH基因重排的高通量测序检测的试剂盒和系统。本发明采用高通量测序的手段检测IGH基因重排，可以极大的提高检测灵敏度及准确性，并且可以准确地得到单克隆序列信息，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及基因测序技术领域，尤其涉及一种基于高通量测序的IGH基因重排检测方法。

背景技术

IGH基因主要由可变区(variabl V)、多变区(diversity D)、连接区(joining J)组成，每个基因区域均由多个基因片段组成，其中可变区(V)和连接区(J)中存在的相对保守的结构区(frame work region，FR)，其在V区有3个，分别称作FR1、FR2、FR3，J区也有1个。随着淋巴细胞从母细胞分化到成熟淋巴细胞，原始的IGH基因在重组酶的作用下，剪切各个基因区域中的某一片段，并重新连接，形成新的具有表达功能的基因，即发生基因重排。来源于不同基因片段重排后的基因，保证了表达蛋白的多样，如正常的B淋巴细胞呈现IGH基因重排的多克隆性。

目前IGH重排的检测主要的分子生物学手段为一代测序平台的毛细管电泳+片段分析，即利用带有荧光标记的引物序列，特异性的扩增IGH基因区域，通过跑毛细管电泳的方法，形成显示不同片段大小分布的峰图，从而得到IGH基因在体内的单克隆情况。但该分析方法存在以下缺点：

1.检测灵敏度低，由于技术平台的限制，单克隆检测灵敏度较低；

2.存在假阳性状况，由于判读标准是序列读长，会导致部分序列不同，长度相同的扩增片段混淆；

3.应用范围窄，目前主要应用于淋巴系统疾病肿瘤性或增生性的判断。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明采用高通量测序的手段检测IGH基因重排，相比于目前的方法，可以极大的提高检测灵敏度及准确性，并且可以准确地得到单克隆序列信息，具有广泛的应用前景，例如得到的受体识别区序列可以应用在细胞免疫研究领域；由于极高的灵敏度可以用于一些肿瘤性疾病的微小残留病灶监测等等。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种基于高通量测序的IGH基因重排检测方法，其包括如下步骤：

步骤1)根据已知的IGH基因序列，设计及合成扩增引物；

步骤2)采用扩增引物对扩增片段进行多重扩增反应，获得IGH扩增引物；

步骤3)对IGH扩增产物进行纯化，并对纯化后的产物进行末端修饰；

步骤4)将修饰后的扩增产物与高通量测序平台的接头进行连接并进行连接修复，对连接修复产物进行纯化，得到高通量测序文库；

步骤5)将高通量测序文库上机测序及数据分析；

其中，所述扩增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的设计位置分别位于FR1、FR2和FR3区域，所述反向引物的设计位置位于保守区J区。

为了进一步优化上述IGH基因重排检测方法，本发明还包括如下技术措施：

进一步地，FR1区的正向引物为23条，扩增目的片段长度为370bp；FR2区的正向引物为34条，扩增目的片段长度为260bp；FR3区的正向引物为33条，扩增目的片段长度为370bp；J区的反向引物共4条。