[发明专利]用于检测NR1H3基因95bp缺失可变剪接体的引物、试剂盒及检测方法在审
| 申请号： | 201910242593.5 | 申请日： | 2019-03-28 |
| 公开（公告）号： | CN109777879A | 公开（公告）日： | 2019-05-21 |
| 发明（设计）人： | 张雪莲;曹果清;张万锋;乐宝玉;张宁芳;成志敏;秦本源;高鹏飞;郭晓红;蔡春波;李步高 | 申请（专利权）人： | 山西农业大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6888 | 分类号： | C12Q1/6888;C12Q1/6851;C12N15/11 |
| 代理公司： | 北京路浩知识产权代理有限公司 11002 | 代理人： | 王文君;黄爽 |
| 地址： | 030801 山西省晋中市太*** | 国省代码： | 山西;14 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 可变剪接体 基因 检测 试剂盒 引物 剪接 特异性引物 定量分析 表达水平 引物序列 | ||
1.用于检测NR1H3基因95bp缺失可变剪接体的引物，其特征在于，包括引物NX3-F和NX3-R，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-2所示。
2.含有权利要求1所述引物的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于扩增18S内参基因的引物18S-F和18S-R，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3-4所示。
4.权利要求1所述引物、或权利要求2或3所述试剂盒在检测NR1H3基因95bp缺失可变剪接体中的应用。
5.一种检测NR1H3基因95bp缺失可变剪接体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测样本总RNA，反转录成cDNA；
2)以步骤1)的cDNA为模板，利用引物18S-F和18S-R qPCR扩增18S内参基因，同时利用引物NX3-F和NX3-R qPCR扩增NR1H3基因95bp缺失可变剪接体；
3)对步骤2)的qPCR实时监测结果进行扩增曲线和熔解曲线分析，采用2-△△CT相对定量方法计算NR1H3基因95bp缺失可变剪接体在不同组织中的表达量，用SPSS version 20.0进行差异显著性检验并通过GraphPad Prism 5作图。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)中qPCR的反应体系为：2×SYBRPremix Ex Taq II 9～11μL，去RNA酶水7～8μL，10μM上游引物0.3～1μL，10μM下游引物0.3～1μL，cDNA模板0.5～2.0μL；
优选地，反应体系为：2×SYBR Premix Ex Taq II 10μL，去RNA酶水7.4μL，10μM上游引物0.3μL，10μM下游引物0.3μL，cDNA模板2.0μL。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)中qPCR的反应程序为：92～96℃预变性30s～6min；92～96℃变性5～12s，55～65℃退火25～35s，35～45个循环；
优选地，反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，59℃退火30s，45个循环。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述2×SYBR Premix Ex Taq II包括含DNA聚合酶的Ex Taq HS、dNTPs、氯化镁、SYBR Green I和PCR反应缓冲液。
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