[发明专利]用于检测NR1H3基因95bp缺失可变剪接体的引物、试剂盒及检测方法

说明书

本发明提供用于检测NR1H3基因95bp缺失可变剪接体的引物、试剂盒及检测方法。所述用于检测NR1H3基因95bp缺失可变剪接体的引物序列如SEQ ID NO:1‑2所示。本发明利用特异性引物将NR1H3基因的95bp缺失可变剪接体从该基因的多种剪接形式中分离出来，对NR1H3基因95bp缺失可变剪接体的表达水平进行定量分析，准确、快速、方便，具有很强的实用性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及用于检测NR1H3基因95bp缺失可变剪接体的引物、试剂盒及检测方法。

背景技术

肝X受体α(LXRα/NR1H3)是LXR核超受体家族的成员，作为转录调控因子，其活性受到胆固醇降解产物氧化型胆固醇的调节。NR1H3的生理功能主要是维持胆固醇水平、碳水化合物代谢、脂蛋白代谢和脂肪合成的稳态。LXR具有调节组织脂质生物合成的作用，LXRα影响动物的脂肪沉积和脂肪细胞脂质代谢，是肌肉中脂肪生成的正调节因子。猪NR1H3基因在组织中广泛表达，但其多种可变剪接体的鉴别和分离进展相对缓慢，这在一定程度上阻碍了NR1H3基因生理功能的研究。因此利用分子生物学手段鉴别某一剪接体组织表达模式，进而对其生物学功能的阐明具有推动作用，意义重大。

从结构上看，LXRs包含5个结构域，即氨基端的配体非依赖性转录活化结构域、DNA结合结构域、铰链区、配体结合域和羧基端的配体依赖的转录活化域。DNA结合结构域包含一个高度保守的锌指结构，该结构域与靶基因特异DNA结合，启动靶基因的转录，调控靶基因表达；铰链区可保持受体蛋白的稳定性，使受体在二聚化的同时与DNA结合，调控靶基因的表达。

可变剪接体是影响蛋白质发挥功能的重要原因之一。在猪中仅发现一种NR1H3剪接异构体，而且检测繁琐、耗时长、准确率低，因此亟需开发新的检测技术手段，为深入探究剪接体的生物学功能奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供用于检测NR1H3基因95bp缺失可变剪接体的引物、试剂盒及检测方法。

发明人在对猪NR1H3基因克隆和功能研究的过程中发现长度为95bp的第9外显子全部缺失，据此提供一种检测NR1H3基因95bp缺失可变剪接体的引物以及包含该引物的试剂盒及检测方法，可有效解决现有的检测方法程序繁琐、耗时长、准确率低的问题。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供用于检测NR1H3基因95bp缺失可变剪接体的引物，包括引物NX3-F和NX3-R，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-2所示。

第二方面，本发明提供含有所述引物NX3-F和NX3-R的试剂盒。

进一步地，所述试剂盒还包括用于扩增18S内参基因的引物18S-F和18S-R，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3-4所示。

第三方面，本发明提供所述引物NX3-F和NX3-R、或含有上述引物的试剂盒在检测NR1H3基因95bp缺失可变剪接体中的应用。

第四方面，本发明提供一种检测NR1H3基因95bp缺失可变剪接体的方法，包括以下步骤：

1)提取待测样本总RNA，反转录成cDNA；

2)以步骤1)的cDNA为模板，利用引物18S-F和18S-R qPCR扩增18S内参基因，同时利用引物NX3-F和NX3-R qPCR扩增NR1H3基因95bp缺失可变剪接体；

3)对步骤2)的qPCR实时监测结果进行扩增曲线和熔解曲线分析，采用2^-△△CT相对定量方法计算NR1H3基因95bp缺失可变剪接体在不同组织中的表达量，用SPSS version20.0进行差异显著性检验并通过GraphPad Prism 5作图。