[发明专利]产胍基乙酸的工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了产胍基乙酸的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明提供了一种产胍基乙酸工程菌的构建方法，包括如下步骤：将与胍基乙酸合成相关基因L‑精氨酸：甘氨酸脒基转移酶编码基因导入宿主菌，得到产胍基乙酸工程菌；所述宿主菌为大肠杆菌或突变型大肠杆菌。本发明通过表达外源蛋白的方法，在大肠杆菌中构建了本底不存在的AGAT催化反应。同时，通过质粒过表达蛋白、染色体上替换启动子及基因敲除等方式，增强大肠杆菌鸟氨酸循环代谢通路的流量，解除鸟氨酸对AGAT催化反应的抑制，利用全细胞催化法循环利用精氨酸生产胍基乙酸，具有良好的环境与经济前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及产胍基乙酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

胍基乙酸(Guanidinoacetate,GAA)为白色或微黄色结晶性粉末，或片状结晶，常温下在水中的溶解度为4g/L。胍基乙酸是人和动物体内合成肌酸的主要内源性物质,对于肌肉和神经组织的能量代谢，其发挥着无可替代的作用。肌酸既可以从日粮中获得,也可以通过生物体自身合成，所以称其为半必需营养物质。肌酸是细胞内能量新陈代谢的重要分子，能量暂时存储的场所。肌酸被磷酸化后形成磷酸肌酸，是动物肌肉组织中主要的能量供应物质，添加胍基乙酸能够加强机体的能量供应。除了合成肌酸，胍基乙酸还有其他生理功能，其中包括刺激激素合成、调节神经、节约精氨酸和调节细胞氧化状态等。一些欧美国家健美者和力量运动员保健品中也添加少量胍基乙酸，以促进肌肉的生长。在饲料中添加胍基乙酸在一定程度上可弥补纯植物日粮造成的动物生产性能下降，提高动物瘦肉率。所以，胍基乙酸作为新一代无毒害，无副作用的饲料添加剂，受到社会上的广泛关注。总体来说，胍基乙酸有可观的市场需求和良好的市场前景。

目前，胍基乙酸的合成方法主要是化学合成方法，合成工艺大多存在路线复杂，收率不高，副产物处理，对环境不友好等问题。目前，胍基乙酸的化学合成法主要有以下几种方法：

1.硫脲与溴乙烷反应生成S-乙基硫脲氢溴酸盐，氢氧化钠中和,再与甘氨酸反应制得胍基乙酸。

2.由盐酸胍与固体氢氧化钠中和反应生成游离胍，然后与氯乙酸反应制得胍基乙酸。

3.异丙醇、甘氨酸和10％氢氧化钠溶液，室温混合后，滴加单氰胺溶液。反应完毕，减压浓缩，蒸出溶剂，得到胍基乙酸粗品。

上述化学合成方法普遍存在工艺复杂、收率低、产品质量差，副产物回收问题与环境污染问题。现在为止，还没有生物合成胍基乙酸的报道，因此，一种绿色高效合成胍基乙酸的方法显得尤为迫切。

研究发现，甘氨酸和精氨酸可以在甘氨酸-精氨酸脒基转移酶(Glycine-ArginineAmidinotransferase，AGAT，EC:2.1.4.1)的催化下能够利用生成胍基乙酸和鸟氨酸，此酶存在于大多数动物以及极少数原核生物中。大肠杆菌由于研究比较详尽，有着成熟的基因操作体系，繁殖迅速培养代谢易于控制等优点，被作为基因工程菌广泛应用。研究发现，AGAT催化精氨酸生成胍基乙酸的反应被副产物鸟氨酸反馈抑制，因此利用酶法一步合成胍基乙酸的转化率与产量比较低，且底物成本高，难以适用于工业化生产。

发明内容

为了适应工业化生产胍基乙酸，本发明提供了如下技术方案：

本发明的一个目的是提供一种产胍基乙酸工程菌的构建方法，包括如下步骤：将与胍基乙酸合成相关基因L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶编码基因导入宿主菌，得到产胍基乙酸工程菌；所述宿主菌为大肠杆菌或突变型大肠杆菌。

上述方法中，所述L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶为如下A1-A6任一种：

A1.Amycolatopsis kentuckyensis来源的L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶；