[发明专利]一种羊栖菜中岩藻聚糖硫酸酯组分的制备及活性检测方法

权利要求书

1.一种羊栖菜中岩藻聚糖硫酸酯组分的制备方法，其特征在于：

步骤1：取500g羊栖菜洗净，烘干至恒重；

步骤2：将羊栖菜粉碎至60-120目；向粉碎后的羊栖菜中加入2-4L85％乙醇，在60℃回流脱脂2-5h，其间不断搅拌，过滤；

步骤3：将脱脂藻粉中加入1M氯化钙溶液5L，提取温度20-40℃，搅拌4-8h；过滤，收集滤液；滤渣反复提取3次，合并滤液，得到羊栖菜岩藻聚糖硫酸酯提取液；

步骤4：将提取液在40-80℃、真空度-0.05MPa下减压蒸馏浓缩至原体积的1/5；向浓缩液中缓慢加入无水乙醇，使浓缩液中乙醇浓度为80％，4℃静置过夜，5000-12000rpm离心处理30分钟，经无水乙醇清洗后，真空干燥，即得羊栖菜岩藻聚糖硫酸酯；

步骤5：将羊栖菜岩藻聚糖硫酸酯溶解在10mL蒸馏水中，利用DEAE-纤维素离子交换柱层析，用蒸馏水洗脱，回收得到的物体标记为SFF-1，然后分别用0.1M、0.3M、0.5M、1M的NaCl洗脱分别将得到的标记为SFF-2，SFF-3，SFF-4，SFF-5；

步骤6：将步骤5所得产物进一步用Sepharose CL-6B柱层析纯化，用0.15M NaCl洗脱，采用苯酚-硫酸法对洗脱液进行分析，收集合适的馏分制备，并分别标记为SFF-11、SFF-12、SFF-21、SFF-31、SFF-32、SFF-41、SFF-42、SFF-51。

2.根据权利要求1所述的一种羊栖菜中岩藻聚糖硫酸酯组分的制备方法，其特征在于：步骤3中加入氯化钙溶液时，同时用盐酸调节PH值至3-5。

3.根据权利要求1所述的一种羊栖菜中岩藻聚糖硫酸酯组分的制备方法，其特征在于：步骤3中提取温度为25摄氏度，搅拌6h，搅拌时采用搅拌工具搅拌。

4.根据权利要求3所述的一种羊栖菜中岩藻聚糖硫酸酯组分的制备方法，其特征在于：所述搅拌工具为搅拌棒，所述搅拌棒包括转动杆(1)，转动杆(1)的下端沿周向均匀固定有多个混合杆(2)，所述转动杆(1)的上端固定有半球形的手柄(4)。

5.根据权利要求4所述的一种羊栖菜中岩藻聚糖硫酸酯组分的制备方法，其特征在于：所述混合杆(2)的侧壁上设有混合孔(3)，混合孔(3)沿水平方向延伸且其两端开口与转动杆(1)的距离不同。

6.根据权利要求5所述的一种羊栖菜中岩藻聚糖硫酸酯组分的制备方法，其特征在于：所述混合杆(2)与转动杆(1)螺纹连接，所述手柄(4)的下端设有可与混合杆(2)螺纹连接的定位孔(5)。

7.根据权利要求6所述的一种羊栖菜中岩藻聚糖硫酸酯组分的活性检测方法，其特征在于：所述混合杆(2)远离转动杆(1)的一端为球面。

8.一种羊栖菜中岩藻聚糖硫酸酯内组分的分析方法，包括SFF-11、SFF-12、SFF-21、SFF-31、SFF-32、SFF-41、SFF-42、SFF-51，其特征在于：

步骤1：准备中国仓鼠卵巢细胞CHO和人早幼粒细胞白血病细胞HL-60，将人P-选择素cDNA全长转染CHO细胞，获得稳定表达人P-选择素的CHO-P细胞；

步骤2：将CHO或CHO-P细胞接种到24孔板中，形成细胞单层，然后将细胞与阻断型单克隆抗体9E1，非阻断型单克隆抗体AC1.2或100μg/mL的岩藻聚糖硫酸酯各个组分在37℃预孵育1小时，将钙黄绿素标记的HL-60细胞加入预处理的CHO-P或CHO细胞单层中并再温育1小时，用PBS洗涤后，用Tecan Infinite M200酶标仪测量荧光强度，激发和发射波长分别设定在485nm和530nm，通过对比不同组分黏附细胞的百分率来显示不同组分对P-选择素的拮抗作用。