[发明专利]一种羊栖菜中岩藻聚糖硫酸酯组分的制备及活性检测方法

说明书

本发明公开了一种羊栖菜中岩藻聚糖硫酸酯组分的制备及活性分析方法，其技术方案要点包括羊栖菜洗净烘干，粉碎后加入乙醇，回流脱脂并搅拌过滤，脱脂藻粉经氯化钙溶液反复提取3次，合并滤液得到岩藻聚糖硫酸酯提取液；将提取液减压蒸馏浓缩至原体积的1/5；向浓缩液中加入无水乙醇并静置过夜，离心处理并无水乙醇清洗后，真空干燥即得羊栖菜岩藻聚糖硫酸酯；将羊栖菜岩藻聚糖硫酸酯溶解在蒸馏水中，利用DEAE‑纤维素离子交换柱层析分离，用蒸馏水洗脱，然后分别用0.1M、0.3M、0.5M、1M的NaCl洗脱，所得产物用Sepharose CL‑6B柱层析纯化，用NaCl洗脱，采用苯酚‑硫酸法对洗脱液进行分析，收集合适的馏分制备。本发明具有制备羊栖菜岩藻聚糖硫酸酯组分操作简便的优点。

技术领域

本发明涉及一种羊栖菜内活性物质的提取方法，更具体地说它涉及一种羊栖菜中岩藻聚糖硫酸酯组分的制备及活性检测方法。

背景技术

羊栖菜(Sargassum fusiforme或Hizikia fusiformis)属于褐藻门、褐藻纲、墨角藻目、马尾藻科、马尾藻属的一种海洋孢子植物。自上世纪80年代起被誉为“中国羊栖菜之乡”的浙江省温州市洞头县开始大量人工养殖，并主要出口日本。羊栖菜含多种活性物质，素有“长寿菜”的美称，作为药食两用海藻具有较高的开发利用价值。

岩藻聚糖硫酸酯是羊栖菜中的重要活性物质。岩藻聚糖硫酸酯又称褐藻糖胶，是一种水溶性的杂聚多糖。P-选择素介导的内皮细胞和中性粒细胞识别和粘附的重要分子，是治疗急性炎症相关疾病的理想靶点。岩藻聚糖硫酸酯具有拮抗P-选择素的作用，起到抗炎的作用，但是岩藻聚糖硫酸酯具体哪个组分具有拮抗P-选择素的作用，需要进一步研究。在实验过程中人们需要对岩藻聚糖硫酸酯组分进行分离制备，进一步对拮抗P-选择素的功效进行评价。由于羊栖菜在我国沿海常见且可大量培育，因此越来越多的学者关注羊栖菜开发，而现阶段缺乏一种对羊栖菜中岩藻聚糖硫酸酯组分的有效制备工艺。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明在于提供一种羊栖菜中岩藻聚糖硫酸酯组分的制备及活性检测方法，具有制备岩藻聚糖硫酸酯组分方便，并便于分析其对P-选择素的拮抗效果的功能。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种羊栖菜中岩藻聚糖硫酸酯组分的制备方法，其特征在于：

步骤1：取500g羊栖菜洗净，烘干至恒重；

步骤2：将羊栖菜粉碎至60-120目；向粉碎后的羊栖菜中加入2-4L 85％乙醇，在60℃回流脱脂2-5h，其间不断搅拌，过滤；

步骤3：将脱脂藻粉中加入1M氯化钙溶液5L，提取温度20-40℃，搅拌4-8h；过滤，收集滤液；滤渣反复提取3次，合并滤液，得到羊栖菜岩藻聚糖硫酸酯提取液；

步骤4：将提取液在40-80℃、真空度-0.05MPa下减压蒸馏浓缩至原体积的1/5；向浓缩液中缓慢加入无水乙醇，浓缩液中乙醇浓度为80％，4℃静置过夜，5000-12000rpm离心处理30分钟，经无水乙醇清洗后，真空干燥，即得羊栖菜岩藻聚糖硫酸酯；

步骤5：将羊栖菜岩藻聚糖硫酸酯溶解在10mL蒸馏水中，利用DEAE-纤维素离子交换柱层析分离，用蒸馏水洗脱，回收得到的物体标记为SFF-1，然后分别用0.1M、0.3M、0.5M、1M的NaCL洗脱分别将得到的标记为SFF-2，SFF-3，SFF-4，SFF-5；

步骤6：将步骤5所得产物进一步用Sepharose CL-6B柱层析纯化，用0.15M NaCl洗脱，采用苯酚-硫酸法对洗脱液进行分析，收集合适的馏分制备，并分别标记为SFF-11、SFF-12、SFF-21、SFF-31、SFF-32、SFF-41、SFF-42、SFF-51。