[发明专利]一种测定恒河猴血清中T-DM1释放DM1浓度的检测方法在审
| 申请号： | 201910249381.X | 申请日： | 2019-03-29 |
| 公开（公告）号： | CN109856293A | 公开（公告）日： | 2019-06-07 |
| 发明（设计）人： | 杨勇;张先锋;钟勘;姜金方;毛凯平;胡凤梅;马娇 | 申请（专利权）人： | 苏州海科医药技术有限公司 |
| 主分类号： | G01N30/06 | 分类号： | G01N30/06;G01N30/88 |
| 代理公司： | 苏州唯亚智冠知识产权代理有限公司 32289 | 代理人： | 宋秀丽 |
| 地址： | 215000 江苏*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 涡流 二硫苏糖醇 恒河猴 血清 蛋白沉淀处理 还原反应 甲醇溶液 仪器检测 释放 灵敏度 工作液 猴血清 离心管 消耗量 检测 加样 内标 取食 水浴 孵化 分析 | ||
1.一种测定恒河猴血清中T-DM1释放DM1浓度的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
加样，取食蟹猴血清样品25.0μL，置于1.5mL离心管中，加25.0μL内标工作液和25.0μL二硫苏糖醇溶液，涡流1min，其中，内标工作液采用左炔诺孕酮以甲醇溶解并动容，浓度约为1.00mg/mL的内标贮备液，然后以甲醇-水分步稀释获得，加样中的二硫苏糖醇溶液的浓度为1.00mg/mL，且以pH7.4磷酸缓冲液配制，内标工作液的浓度为200ng/mL，
还原反应，40℃水浴孵化1h；
分离DM1和内源性蛋白，加入200μL二硫苏糖醇甲醇溶液蛋白沉淀处理，涡流1min，以14000rpm离心5min，其中，二硫苏糖醇甲醇溶液的浓度为1.00mg/mL；
仪器检测，取10μL进行LC-MS/MS分析，其中，
仪器检测中的色谱条件，采用Eclipse Plus C18色谱柱，梯度洗脱，流速0.5μL/min，柱温40℃，进样量2.0μL，流动相A为5mM醋酸铵水溶液，流动相B为乙腈，流动A中含有0.3％甲酸；
仪器检测中的质谱条件，电喷雾电离源，电压为4000V；离子源温度为450°C；Gas1、Gas2、Curtain Gas和CID压力分别为70、70、35和9psi，扫描模式为+MRM，监测离子反应分别为：DM1，准分子离子，m/z738.2→m/z547.2，左炔诺孕酮，m/z313.2→m/z245.2，CE分别为36和25eV；DP为80V，扫描时间为50ms，Eclipse Plus C18色谱柱长50mm，直径2.1mm。
2.根据权利要求1所述的一种测定恒河猴血清中T-DM1释放DM1浓度的检测方法，其特征在于：采用蛋白沉淀法分离DM1和内源性蛋白，并在沉淀剂中加入二硫苏糖醇防止DM1与内源性蛋白进一步结合。
3.根据权利要求1所述的一种测定恒河猴血清中T-DM1释放DM1浓度的检测方法，其特征在于：检测血清中DM1，质谱监测前体离子或母离子为DM1的准分子离子，即m/z738.2。
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