[发明专利]一种测定恒河猴血清中T-DM1释放DM1浓度的检测方法

说明书

本发明涉及一种测定恒河猴血清中T‑DM1释放DM1浓度的检测方法，包括以下步骤：加样，取食蟹猴血清样品25.0μL，置于1.5mL离心管中，加25.0μL内标工作液和25.0μL二硫苏糖醇溶液，涡流1min；还原反应，40℃水浴孵化1h；蛋白沉淀处理，加入200μL二硫苏糖醇甲醇溶液，涡流1min，以14000rpm离心5min；仪器检测，取10μL进行LC‑MS/MS分析。本发明主要解决原有技术灵敏度低、样品消耗量大、操作复杂等问题。

技术领域

本发明涉一种测定恒河猴血清中T-DM1释放DM1浓度的检测方法。

背景技术

抗体-药物偶联物(Antibody-drug conjugate，ADC)是一种将小分子细胞毒类药物通过linker与单克隆抗体之间偶联的产物。单克隆抗体具有高靶向性，可以携带细胞毒类药物进入病灶肿瘤组织，大大减小对正常组织的伤害。KadcylaTM(tratuzumab-DM1，T-DM1)于2013年2月被美国FDA批准用于治疗HER2阳性晚期转移性乳腺癌。T-DM1由一分子曲妥珠单克隆抗体(tratuzumab)和小分子微管类药物DM1通过合成的linker(MCC)偶联而成。平均每分子曲妥珠连接3.5分子DM1。Tratuzumab是乳腺癌治疗领域的第一个分子靶向人源化单克隆抗体药物。Tratuzumab通过结合乳腺癌细胞膜上的HER2受体干扰信号转导通路，促使细胞周期阻滞，抑制肿瘤细胞的生长。T-DM1利用tratuzumab靶向于乳腺癌细胞，随后在细胞内吞作用下进入细胞内，并在细胞溶酶体内断裂释放出DM1。DM1进入细胞核内阻止细胞有丝分裂，杀死肿瘤细胞。由于ADC药物的作用机制比小分子化药和单克隆抗体更复杂，包括了靶向、内化、溶酶体裂解、细胞毒素进入细胞核发挥药效等多个过程。为了保证足够的抗肿瘤作用，细胞毒物的毒性必须非常高，一般为常规化疗药物毒性的100到1000倍。DM1是抑制微管蛋白聚合的化合物，机理和长春碱类化合物相同，活性是后者的20到100倍。由于DM1毒性巨大，其体内暴露量是评价T-DM1安全性的重要参数。

目前检测DM1的技术主要为液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)，DM1结构中含有巯基，在体外快速血清蛋白等含巯基的分子结合形成二硫键，使样品中DM1浓度迅速降低，影响测定的准确性。为了准确测定DM1的浓度，现有技术使用如下两步化学反应处理样品：1将样品中二硫键还原后再分析DM1的浓度；2为防止巯基再次结合血清蛋白，使用N-乙基马来酰亚胺(N-ethyl maleimide，NEM)将DM1游离巯基进一步衍生化，保护巯基。由于化学反应每步回收率不能达到100％，步骤越多回收率越低，样品中最终待测物的浓度越低，降低检测灵敏度。步骤较多还会使检测速度变低，增加时间人力成本。

Olivier等使用了相同的衍生化预处理方法，建立了测定人血清中DM1的分析方法血清样品使用三(2-羧乙基)膦(tris-(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP)还原所有氧化型DM1。为防止巯基再次结合血清蛋白，随后使用N-乙基马来酰亚胺(N-ethyl maleimide，NEM)将DM1游离巯基衍生化。样品经蛋白沉淀及在线固相萃取处理后，经液相色谱-串联质谱检测，测定DM1的线性范围为0.200-200ng/mL。Randall dere等利用LC-MS/MS测定DM1血浆浓度，该检测技术中使用方法与Olivier等建立的技术基本一致。该方法的LLOQ为0.737ng/mL。检测灵敏度较低，无法满足非临床药动学研究需求。两种方法均使用了较复杂在线固相萃取设备，设备成本提升，方法开发难度加大，限制了该方法的应用范围。YazhongLiu等建立了LC-MS/MS测定细胞内DM1浓度。由于细胞内蛋白浓度较低，稳定性结果显示，DM1未发生二硫键结合反应，因此该方法未采用化学反应处理样品。但由于血浆或血清中蛋白含量较高，有二硫键结合反应导致DM1降低。该方法不适用于药动学研究中血浆或血清样品的测定。另外此分析方法的灵敏度较低，为0.737ng/mL。

综上所述，现有技术有以下缺点：

涉及两步化学反应、耗时、操作复杂、检测效率低、不同实验室间重现难度较大，增加方法开发的成本。