[发明专利]一种微囊藻毒素抗体Fab片段的制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种微囊藻毒素抗体Fab片段的制备方法和应用。本发明首先提供了一种微囊藻毒素抗体Fab片段的氨基酸序列和核苷酸序列，依次如SEQ ID NO：1～4所示。本发明还提供了一种微囊藻毒素抗体Fab片段的制备方法，用蛋白酶酶切微囊藻毒素抗体IgG，酶切产物直接采用凝胶过滤层析进行纯化，即可得到Fab片段。该方法仅使用凝胶过滤层析便可获得生物活性高、纯度高的Fab片段，成功实现了一步法高效纯化Fab片段。另外，该方法步骤少，操作流程简易，使用的凝胶过滤层析介质可再生，大大降低了成本，是一种低成本、高产出的高效制备微囊藻毒素Fab片段的方法，为建立微囊藻毒素的免疫分析检测方法提供了核心材料，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，更具体地，涉及一种微囊藻毒素抗体Fab片段的制备方法和应用。

背景技术

随着工业化、城市化的发展，大量营养物注入水中造成水体富营养化，致使藻类迅猛生长，我国是世界上藻灾害最为严重的国家之一。藻类代谢产生包括蓝绿藻肝毒素(微囊藻毒素，节球藻毒素)在内的有毒物质，危害着人类健康，其中微囊藻毒素分布最广、毒性最大。微囊藻毒素(Microcystins，MCs)是一类单环七肽肝毒素，其中2位与4位的氨基酸组成主要有亮氨酸(L)、精氨酸(R)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)和苯丙氨酸(F)，目前已经确定的微囊藻毒素有100多种。MCs已被证实对蛋白磷酸酶1和蛋白磷酸酶2A具有抑制作用，是强烈的肝脏肿瘤促进剂，其中MC-LR/RR/YR毒性最强。MCs通过饮用水和积累在水产品中进行人类食物链，严重危害人类和生态安全，因此加强MCs的检测已十分必要。我国生活饮用水卫生标准(GB5749-2006)中将饮用水中微囊藻毒素含量限制为1μg/L，该标准的实施对水源水的质量提出了更高的要求。

在现有的检测方法中，免疫分析方法具备快速、灵敏、准确、操作简便等特点，特别适用于水源地样品的现场快速检测。免疫分析方法的建立需要获得高质量的抗体，其中抗原结合片段(antigen-binding fragment,Fab)由于较好地保持了天然抗体分子的抗原结合部位结构，而且具有分子量小、免疫原性低、穿透性强、不与Fc受体结合等特点，因而被用于临床诊断治疗、食品安全检测和生命科学等领域中，在小分子有害物现场快速免疫检测中具有广泛的应用价值。

目前，以天然抗体IgG为原料，制备Fab片段的主要方法为酶解法。通过蛋白酶作用于IgG铰链区附近的肽键，将完整的IgG水解为Fab片段和可结晶片段(fragmentcrystallized，Fc)，然后对酶解产物进行纯化，获得单一的Fab片段。抗体酶解后产物成分较为复杂，现有纯化方法较难实现Fab片段的一步分离。纯化Fab片段第一步通常是采用亲和层析，常见的亲和层析有蛋白A配体、蛋白G配体。然而，研究表明二者对于酶切反应产物中的Fab片段和Fc片段均有结合作用，无法高效分离二者。蛋白L配体可以通过与Kappa型轻链的Fab片段发生特异性结合，但对于轻链为Lambda型的抗体没有效果。此外，在亲和填料每批纯化过程中，存在配基脱落的风险导致载量降低，在长期生产过程中需要定期更换亲和填料，造成实验成本高昂。亲和色谱较难实现完整的抗体和Fab片段的分离，后续需使用离子交换、疏水层析、凝胶过滤层析等手段进行二步纯化，而多种纯化手段的组合会降低得率。因此，研究Fab片段的高效制备方法，对Fab片段的应用具有重要意义。

有研究发现，由琼脂糖偶联葡聚糖制备的凝胶过滤层析介质，随着葡聚糖偶联数量的增加，层析介质与蛋白质之间的疏水作用也会增加。此外，凝胶过滤层析填料表面存在少量负电荷，由于蛋白是两性物质，缓冲液中当pHpI时，蛋白表面会携带负电荷，与凝胶过滤层析介质产生离子排阻作用；当pHpI时，蛋白表面携带正电荷，与凝胶过滤层析介质产生离子交换作用。因此，改变缓冲液中的pH和离子强度可以调节蛋白质与层析介质之间的相互作用。目前，尚未有报道直接单独使用凝胶过滤层析一步纯化法分离纯化Fc片段与Fab片段，获得纯度高、生物活性高的Fab片段的方法。

发明内容