[发明专利]一种结核杆菌PUP蛋白过表达菌株的制备及其应用

权利要求书

1.结核杆菌Pup-蛋白酶体系统的重组穿梭质粒制备，其特征在于，包括以下步骤：

1.1 BCG接种及培养

用改良罗氏固体培养基分别接种卡介苗菌株(以下简称BCG)，并置于37℃培养箱中培养3-4周；

1.2 构建及鉴定结核杆菌Pup-蛋白酶体系统的重组穿梭质粒

1.2.1 BCG菌株基因组DNA的制备

分别挑取适量BCG菌株至无菌 EP管中，加入400μL 1×TE buffer，充分震荡混匀后，放于80℃水浴箱内灭活30min；加入25%蔗糖溶液50μL，10%SDS 500μL ，125g/L溶菌酶80μL及20g/L蛋白酶K 20μL，充分混匀后37℃水浴过夜；第二日取出EP管，12000rpm，4℃，离心10min，移上清至一新无菌EP管内；加入酚︰氯仿：异戊醇（25:24:1）约700μL，常温上下温和混匀10min后，12000rpm，4℃离心10min；移上清至一新EP管，加入10g/L Rnase 50μL，37℃温育1h；加入酚︰氯仿：异戊醇（25:24:1），常温上下温和混匀10min后，12000rpm，4℃离心10min；移上清至一新EP管，加入等体积酚︰氯仿︰异戊醇(25︰24︰1），充分混匀10min后，12000rpm，4℃离心10min；移上清至一新EP管，加入等体积预冷无水乙醇（约700μL）混匀10min后，置于-20℃冰箱沉淀过夜；从冰箱中取出EP管，12000rpm，4℃离心10min；弃上清，加70%乙醇洗涤沉淀，上下混匀10min；12000rpm，4℃离心10min；弃上清，室温干燥30min使乙醇挥发完全；加入1×TE buffer 50-100μL，吹打混匀，4℃放置3h后置于-20℃贮存备用，并从各样本DNA中取2ul，利用1%浓度的琼脂糖凝胶电泳鉴定及紫外分光光度计检测分析DNA浓度及纯度；

1.2.2引物的设计

由GenBank数据库中查出BCGPup基因序列，根据质粒pMV361图谱选择合适的酶切位点，并设计引物，Pup 基因引物为

Sequence(5′-3′) F:CATAAGCTTATGGCGCAAGAGCAGACCAAGCG

R:TGAGAATTCTCACTGTCCGCCCTTTTGGACGT

1.2.3 目的基因的PCR扩增

1.2.4 基因PCR扩增产物的回收

1.2.5 质粒pMV361的提取

吸取5mL培养过夜的含质粒pMV361大肠杆菌菌液分次加入2mL EP管中，12000rpm离心1min，尽量吸除上清；为平衡吸附柱，向吸附柱CP3中加平衡液BL 500μL，12000rpm离心1min；加入P1溶液250μL至含菌体沉淀的2mL EP管中，使用涡旋振荡器剧烈震荡，使菌体沉淀充分悬浮；再向其中加入P2溶液250μL，即刻温和上下翻转数次以充分裂解菌体；向其中加入P3溶液350μL，即刻温和地上下翻转数次，EP管底部会出现白色絮状沉淀，12000rpm离心10min；将收集的上清液转移到吸附柱中，12000rpm离心45s，弃废液；加入漂洗液PW 600μL至吸附柱中，12000rpm离心1min；重复漂洗一次；将吸附柱12000rpm空离2min使漂洗液尽量除尽；为防止含乙醇的漂洗液残留可能影响后续实验，将吸附柱CA2开盖放至一个灭菌EP中，超净台放置15min；向吸附柱CA2的吸附膜中央位置悬空滴加洗脱缓冲液EB 50μL，静置2min后，12000rpm离心2min；将EP管中的溶液重新加入吸附柱中，静置2min后，12000rpm离心2min，EP管中即为质粒pMV361，置于-20℃冰箱保存；

1.2.6 质粒pMV361的提取

吸取5mL培养过夜的含质粒pMV361大肠杆菌菌液分次加入2mL EP管中，12000rpm离心1min，尽量吸除上清；为平衡吸附柱，向吸附柱CP3中加平衡液BL 500μL，12000rpm离心1min；加入P1溶液250μL至含菌体沉淀的2mL EP管中，使用涡旋振荡器剧烈震荡，使菌体沉淀充分悬浮；再向其中加入P2溶液250μL，即刻温和上下翻转数次以充分裂解菌体；向其中加入P3溶液350μL，即刻温和地上下翻转数次，EP管底部会出现白色絮状沉淀，12000rpm离心10min；将收集的上清液转移到吸附柱中，12000rpm离心45s，弃废液；加入漂洗液PW 600μL至吸附柱中，12000rpm离心1min；重复漂洗一次；将吸附柱12000rpm空离2min使漂洗液尽量除尽；为防止含乙醇的漂洗液残留可能影响后续实验，将吸附柱CA2开盖放至一个灭菌EP中，超净台放置15min；向吸附柱CA2的吸附膜中央位置悬空滴加洗脱缓冲液EB 50μL，静置2min后，12000rpm离心2min；将EP管中的溶液重新加入吸附柱中，静置2min后，12000rpm离心2min，EP管中即为质粒pMV361，置于-20℃冰箱保存；

1.2.7 质粒pMV361的酶切、纯化

分别加入限制性内切酶HindIII和EcoRI酶切质粒pMV361，37℃水浴条件下3h，利用2%浓度琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收DNA片段；

1.2.8 目的基因扩增产物的酶切、纯化

利用限制性内切酶HindIII和EcoRI双酶切目的基因（Pup、Mpa、Dop和PafA）扩增产物，37℃水浴条件下3h，利用2%浓度琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收DNA片段；

1.2.9 目的基因与质粒pMV361的连接

1.2.10大肠杆菌E.coli DH5α感受态的制备

①取出实验室已保存于-80℃冰箱的大肠杆菌E.coli DH5α克隆菌种，在LB平板（不含抗生素）上划线接种，37℃倒置培养过夜；②在超净台中挑取单菌落接种到5mL LB液体培养基（不含抗生素）中，180rpm/min摇床37℃震荡培养过夜；③吸取1000μL培养过夜的菌液加入到100mL LB液体培养基（不含抗生素）中，180rpm/min摇床37℃震荡培养至OD600值为0.4-0.6（约3h）；④吸取1.5mL菌液至提前预冷的2mL离心管，冰上放置10min，置于4℃离心机中，3000rpm离心10min；⑤弃去上清并吸尽其中残液，向EP管中加入750μL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，冰上放置15min，置于4℃离心机中，3000rpm离心10min；

1.2.11 质粒pMV361/PCR回收产物连接液的转化

①将10μL连接液加入到100μL E.coli DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；②42℃水浴热激90sec（避免摇动）后，即刻冰浴10min；③加入800μL不含抗生素的LB液体培养基；④150rpm/min摇床37℃震荡培养45min；⑤3000rpm离心20sec，弃部分上清，仅留150μL液体重悬菌体，用无菌涂布棒分别涂布于含有0.05g/L Kana的LB平板上，先正置30min使菌液吸收完全，再置于37℃培养箱倒置培养过夜；

1.2.12 重组穿梭质粒的鉴定

挑取单菌落进行菌液PCR初步筛选，并将阳性克隆子接种于含0.05g/L Kana的LB液体培养基中，37℃振摇过夜培养，次日抽提质粒后行双酶切鉴定,将重组穿梭质粒命名为pMV361/Pup，送华大基因公司测序；

重组穿梭质粒pMV361/Pup的测序鉴定。