[发明专利]一种结核杆菌PUP蛋白过表达菌株的制备及其应用

说明书

本发明公开了一种构建结核杆菌类泛素样蛋白PUP过表达菌株的制备及其应用，培养BCG菌株并提取其基因组DNA。以BCG菌株基因组DNA为模板，PCR扩增结核杆菌Pup蛋白基因；测序、鉴定。以大肠杆菌‑结核分枝杆菌穿梭质粒pMV361为载体，构建及鉴定重组穿梭质粒pMV361‑Pup：BCG。利用电穿孔技术将构建的重组大肠杆菌‑结核分枝杆菌穿梭质粒pMV361载体（重组穿梭质粒pMV361‑Pup：BCG），转入BCG菌株，构建及鉴定结核杆菌Pup蛋白过表达菌株，命名为BCG：Pup菌株。该菌株可用于研究结核杆菌类泛素样蛋白酶体系统相关蛋白PUP在结核分枝杆菌在宿主内的生长、耐药性、渗透性调节、耐酸性、致病性等方面的作用，以及用于干预和治疗结核病的新型疫苗的开发和研究。

技术领域

本发明涉及基因工程、疫苗研究领域，涉及一种结核杆菌PUP蛋白过表达菌株的制备及其应用。

背景技术

结核病是由结分枝核杆菌(Mycobacterium Tuberculosis) 感染引起的一种世界性传染病，也是单一致病菌感染导致死亡率最高的感染性疾病。目前结核病依然是全球感染性疾病的头号杀手。世界卫生组织发布的《2017全球结核病报告》公布的新数据显示：2017年世界范围内估计有1040 万新发病例，其中男性590万（56%），女性350万（34%），儿童100万（34%）。印度、印度尼西亚、中国、尼日利亚、巴基斯坦和南非这六个国家占了新发病例总数的60%。结核病疫情未能获得控制，究其根本原因是缺乏有效的疫苗预防结核病的发生。

Pup-蛋白酶体系统(prokaryotic ubiquitin like protein-proteasomesystem, PPS)主要负责介导结核杆菌(Mycobacterium Tuberculosis, Mtb)中蛋白质的选择性降解,并对Mtb的致病性及其引起的宿主免疫应答等过程的调控起重要作用。其中泛素样蛋白(prokaryotic ubiquitin-like protein, Pup)能够对结核杆菌中待降解的蛋白质进行识别和修饰，然后送入结核杆菌蛋白酶体进行降解。该系统中的PUP蛋白对结核杆菌对宿主机体的感染、治病，以及在宿主体内长期留活并产生耐药性都起到关键的作用。

近些年来，由于新型高效的抗结核药以及新型的疫苗研发进展缓慢，使得结核病的防治工作更加严峻，本发明构建的新型菌株为深入研究与结核杆菌Pup-蛋白酶体系统相关的致病机制提供可能，也可以进一步研发干预和治疗结核病的新型改良菌株疫苗。

发明内容

发明的目的在于提供一种结核杆菌PUP蛋白过表达菌株的制备及其应用，针对目前结核病发病和控制情况的严峻性以及预防结核病研制新疫苗的迫切性，考虑结核杆菌Pup-蛋白酶体系统对于结核病致病性及其引起的宿主免疫应答等过程的调控起重要作用，本发明运用重组穿梭质粒技术将PUP蛋白过表达基因导入卡介苗（BCG），制备出一种结核杆菌PUP蛋白过表达菌株，为深入研究与结核杆菌Pup-蛋白酶体系统相关的致病机制提供可能，也可以进一步研发干预和治疗结核病的新型改良菌株疫苗。

本发明目的一是制备一种结核杆菌类泛素样蛋白PUP过表达菌株，用于结核病干预和治疗的新型疫苗开发和研究。

本发明目的二是将构建的结核杆菌类泛素样蛋白PUP过表达菌株命名为： “BCG：Pup菌株”

本发明目的三是提供制备结核杆菌类泛素样蛋白PUP过表达菌株的方法。

本发明目的四是通过检测结核杆菌类泛素样蛋白PUP过表达菌株蛋白PUP的表达量，分析此蛋白对菌株在耐药性、耐酸性和渗透性变化上的差异及其相应功能特点。

其技术方案如下：

一种结核杆菌类泛素样蛋白PUP过表达菌株的制备，包括以下步骤：

1） 根据BCG菌株设计引物。

Pup 基因引物为