[发明专利]唾液中几种类固醇激素的定性定量检测方法

权利要求书

1.一种人体唾液中几种类固醇激素的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：

1)将人体唾液样本冷冻处理后经蛋白沉淀，超声提取并过滤，随后与内标液混合，反相SPE柱纯化和目标产物的化学衍生得到待测样本；

2)将上述待测样本通过液相色谱和质谱联用检测，同步对几种激素进行定性和定量的批量检测。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤中样本冷冻时间为>24小时、温度为-20℃。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤中蛋白沉淀所用的有机溶剂包括甲醇、乙腈或丙酮，优选的有机溶剂为甲醇，温度为4℃，时间为>10分钟。

4.根据权利要求1所述的检测方法，所述步骤中反相SPE的洗脱溶剂为甲醇或丙酮。

5.根据权利要求1所述的检测方法，所述步骤中化学衍生的试剂为乙酰肼三甲基氯化铵或吡啶酰氯、羟胺、甲基羟胺、邻羟基胺等肟化衍生试剂中的一种；所述的化学衍生法反应时间为5-30分钟，反应温度为50-70℃。

6.根据权利要求1-5项任一项所述的检测方法，其特征在于，所述步骤具体包括以下步骤：步骤1)称取8种激素的标准品，用甲醇溶解得到不同浓度的标准液；

步骤2)称取内标样品定容为内标液，随后加入步骤1)中的标准液，超纯水定容后离心，取上清液作为待测标准液；

步骤3)将步骤2)中得到的待测标准液和权利要求1中得到的待测样本通过液质联用检测，经过标准曲线计算得到唾液中8种激素的种类和含量。

7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤3)中液质联用检测的液相色谱条件为：

色谱柱为键合相色谱柱，进样量为5-50μL，流动相A为水，0.01％TFA，流动相B为乙腈甲醇的混合溶液，0.01％TFA，乙腈与甲醇的质量比为9-1:1-9；

流动相的流速为0.1-2.0mL/min；流动相的梯度(以体积百分比计)：

0-1min,A:100-80％,B:0-20％；

1.1-4min,A:80-20％,B:20-80％；

4.1-5min,A:20-0％,B:80-100％；

5.1-6min,A:0-80％,B:100-20％；

6.1min,A:80-100％,B:20-0％。

8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述键合相色谱柱为C18或C8等键合相色谱柱，规格为50-100mm*1.8-3mm,1.8-3μm。

9.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤3)中液质联用检测的质谱条件为：采用电喷雾(ESI)离子源，正离子MRM扫描方式，雾化气流速为5-10L/min，气帘气流速为5-20L/min，离子源电压为2000-4500V，离子源温度为200-400℃。

10.根据权利要求1-7任一项所述的检测方法，其特征在于，所述包括人体唾液中8种类固醇激素；

采用多反应监测的质谱扫描模式，目标物的离子对监测如下：脱氢表雄酮(m/z402.4–343.2)；17-羟基孕酮(m/z444.5–385.3)、孕酮(m/z428.5–369.3)、雄烯二酮(m/z440.4—381.2)、睾酮(m/z402.4–343.2)、皮质醇(m/z476.5–417.3)、皮质酮(m/z474.5–415.3)、醛固酮(m/z474.5–415.3)。