[发明专利]一种近红外光调控基因编辑方法

说明书

本发明公开了一种近红外光控基因编辑的方法。本发明的UCNPs‑Cas9复合体由羧酸化后的UCNPs@SiO₂在4‑羟甲基‑3‑硝基苯甲酸作用下共价连上CRISPR/Cas9体系得到，并在裹上一层PEI后，该纳米粒子可被细胞内吞。之后，在红外光照射下，上转换纳米粒子可发射出紫外光，切断Cas9蛋白和上转换纳米粒子的连接，从而释放出蛋白，使蛋白得以进入细胞核，实现基因编辑。由于红外光的强组织穿透性，使得本发明在活体应用上，优势明显。

技术领域

本发明属于生物技术领域，公开了一种近红外光调控基因编辑的方法。

背景技术

簇状规则间隔短回文重复序列（CRISPR）相关蛋白9（Cas9）技术是当前最为热门的一种基因编辑工具，它依靠一段RNA（sgRNA）进行位点识别，通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）纠正基因突变。然而，CRISPR/Cas9系统由于同时需要传递两个大分子：Cas9蛋白（约160 kd）和sgRNA（超过100 bp），因此它的递送一直是个问题，特别是在时空上精确地控制CRISPR/Cas9系统的递送方面上。近几十年来，基于刺激响应纳米材料设计的按需传递体系在纳米医药中得到了广泛的关注。在各种各样的控制策略中，光调控已被证明是一种理想的无创方式。通过光，生物活性分子的释放可以很容易地被监测到，且具有很高的时空精度。到目前为止，已经开发出几种光敏分子，如偶氮苯衍生物、螺吡喃衍生物和带邻硝酸苄基基团的光敏分子。这些分子在能在高能量的紫外光下发生光异构化或酯键断裂。然而，紫外线生物体穿透能力比较差且长时间照射易引起癌变。因此，利用红外光调控基因编辑尤具前景。

发明内容

为了红外光调控基因编辑的目的，本发明将Cas9体系利用4-羟甲基-3-硝基苯甲酸共价连接在上转换纳米粒子（UCNPs）上。由于上转换纳米粒子可以在红外光激发下发出紫外光，使得4-羟甲基-3-硝基苯甲酸和纳米粒子表面形成的酯键断裂，从而释放出Cas9体系，使其（即Cas9/sgRNA）进入细胞核，实现活细胞基因编辑。

为了实现上述发明目的，本发明涉及的近红外光调控基因编辑的方案如下：一种可用于红外光基因编辑的UCNPs-Cas9@PEI复合体，该复合体的制备过程为：将纳米粒子UCNPs@SiO₂表面进行羧酸化，然后借助光敏分子将CRISPR/Cas9体系和纳米粒子UCNPs@SiO₂共价连接得到UCNPs-Cas9复合体，其中CRISPR/Cas9体系包括Cas9蛋白和目标基因的sgRNA，并在静电吸附的作用下，在UCNPs-Cas9复合体最外层包裹上带正电的PEI，得到UCNPs-Cas9@PEI复合体；当把UCNPs-Cas9@PEI复合体递送进细胞或者小鼠，可在红外光调控下实现基因编辑。

所述的UCNPs@SiO₂是包裹了一层二氧化硅的上转换纳米粒子，其中上转换纳米粒子为NaYF₄:Yb/Tm。

所述的羧酸化过程采用的分子为N-三甲氧基硅丙基乙二胺三乙酸三钠盐（CAS#:128850-89-5），羧酸化反应时N-三甲氧基硅丙基乙二胺三乙酸三钠盐的浓度6 μg/mL。

所述的光敏分子为4-羟甲基-3-硝基苯甲酸（分子量：181.15，CAS#：3113-71-1），光敏反应时4-羟甲基-3-硝基苯甲酸浓度为10 μg/mL。

所述的Cas9蛋白和sgRNA质量比为1:2。所述的PEI中文名称为聚乙烯亚胺（分子量：10000），与加入的sgRNA质量比为5:1。

所述的UCNPs-Cas9@PEI复合体中的UCNPs@SiO₂终浓度为3.5 mg/mL，Cas9 蛋白终浓度0.36 μg /mL，sgRNA 终浓度0.72 μg /mL。

所述的红外光调控过程中，采用的红外光波长980 nm，光照时长20 min。