[发明专利]一种亚洲棉原生质体的分离与外源基因转化的方法

权利要求书

1.一种亚洲棉原生质体的分离与外源基因转化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取饱满的亚洲棉种子，黑暗环境下萌发生长；

(2)取步骤(1)生长至8-10天的子叶，切成细条放入酶解液中，抽真空，然后将酶解液及子叶转移至无菌锥形瓶中，黑暗培养10-16h，黑暗培养条件为25℃摇床，50r/min；

(3)向步骤(2)处理后的酶解液内加入等体积预冷的W5溶液后轻轻摇晃，释放原生质体，低速离心，离心速度为100g，且加减速设为1，离心时间2min，弃上清；

(4)向步骤(3)中保留溶液内加入预冷的W5溶液重新悬浮原生质体，低速离心，弃上清，加入适量W5溶液重新悬浮收集原生质体；

(5)将步骤(4)中原生质体放在冰上静置30min，弃上清液加入预冷的Mmg溶液重新悬浮原生质体，并通过细胞计数板计数；

(6)将步骤(5)中原生质体装至圆底离心管，加入载体；轻轻混匀，再加入等体积的40％PEG-Ca²⁺溶液，轻轻上下颠倒混匀，室温静置18min后加入两倍体积的W5溶液终止转化；

(7)将步骤(6)中的混合物低速离心后吸去40％PEG-Ca²⁺溶液，加入等体积W5溶液，低速离心，去上清液，然后加入等体积W5溶液，再次低速离心后吸去W5溶液，加入等体积WI溶液，轻轻混匀，低速离心；然后转移至培养板孔中，25℃恒温黑暗培养14-16h；

W5溶液配方为：MES 2mM、KCl 5mM、CaCl₂ 0.125M、NaCl 0.15M，溶剂为ddH₂O；

Mmg溶液配方为：MES 4mM、D-甘露醇0.4M、MgCl₂ 0.015M，溶剂为ddH₂O；

40％PEG-Ca²⁺溶液配方为：PEG4000 40％、D-甘露醇0.4M、CaCl₂ 0.01M，溶剂为ddH₂O；

WI溶液配方为：MES 4mM、D-甘露醇0.5M、KCl 0.02M，溶剂为ddH₂O；

酶解液配方为：Cellulose R10 1.5％、Macerozyme R10 0.4％、D-甘露醇0.6M、KCl0.02M、MES 0.02M、CaCl₂ 0.01M、β-巯基乙醇0.05％、BSA 0.01％。