[发明专利]一种亚洲棉原生质体的分离与外源基因转化的方法

说明书

本发明公开了一种亚洲棉原生质体分离与外源基因转化的方法。该方法包括亚洲棉种子萌发、酶解分离原生质体、离心收集原生质体、培养、外源基因转化及显微观察鉴定等步骤。本发明黑暗环境中生长的叶片所分离的原生质体浓度符合实验需求且完整度高，可得到完整的转化成功的原生质体。因此本发明得出的利用黑暗环境培养的叶片分离原生质体方法，更好地解决了亚洲棉原生质体分离及外源基因转化的难题。亚洲棉原生质体分离及外源基因成功转化，可为开展亚洲棉大规模细胞培养、有目的地导入外源基因及进一步创新和品质改良工作提供基础帮助。

技术领域

本发明属于细胞生物学和分子生物学领域，具体涉及一种亚洲棉原生质体分离与外源基因转化的方法。

背景技术

植物原生质体指的是去除细胞壁的由质膜包被的裸露细胞，具有细胞全能性，可再生成完整的植株，同时，原生质体也是一种理想的单细胞系统。原生质体采用原生质体转化技术可进行基因瞬时表达研究，可获得突变体材料，也可导入外源目的基因以改良植物种质资源。因此，原生质体可以为现代生物技术研究的诸多方面提供有利的试验材料，已被广泛地应用于植物基础理论研究和遗传改良中。原生质体的制备主要有机械法和酶解法，其中机械法制备原生质体具有操作条件剧烈、损伤大、收率低等缺点。目前，人们广泛使用的酶解液组合为纤维素酶+离析酶或纤维素酶+果胶酶，已被成功地用于小麦、马铃薯、油菜、柑橘等植物的原生质体分离。

绿色荧光蛋白(GFP)作为易于检测的报告基因，具有操作技术方便、不需要制样，无特异性标记的影响，在激光共聚焦显微镜的照射下能够自发发出一种绿色荧光，对细胞无害且灵敏度高等优点。GFP在光照下是稳定的，各种光照都不会引起其变性，作为荧光标记分子广泛应用于植物外源蛋白亚细胞定位。

棉花在分类学上属于锦葵科中的棉属，有51个种，包括4个栽培棉种和47个野生棉种。亚洲棉栽培种植株较适应亚洲土壤气候，生长期短，抗逆性强等，对棉花育种有一定价值。亚洲棉是一个古老的二倍体种，具有丰富的遗传多样性，且具有早熟、抗逆性强、纤维强力高、弹性好等一些优良的性状，这些特性正是当前陆地棉栽培种所欠缺的。因此利用亚洲棉为材料应用原生质体分离与转化技术在植物遗传育种、性状改良和遗传转化等领域都具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种亚洲棉原生质体的分离与外源基因转化的方法，可以获得完整度高且浓度满足要求的原生质体，成功进行外源基因的转化与鉴定。

本发明的技术方案为：一种亚洲棉原生质体的分离与外源基因转化的方法，包括以下步骤：

(1)取饱满的亚洲棉种子，黑暗环境下萌发生长；

(2)取步骤(1)生长至8-10天的子叶，切成细条放入酶解液中，抽真空，然后将酶解液及子叶转移至无菌锥形瓶中，黑暗培养10-16h；

(3)向步骤(2)处理后的酶解液内加入等体积预冷的W5溶液后轻轻摇晃，释放原生质体，低速离心，弃上清；

(4)向步骤(3)中保留溶液内加入预冷的W5溶液重新悬浮原生质体，低速离心，弃上清，加入适量W5溶液重新悬浮收集原生质体；

(5)将步骤(4)中原生质体放在冰上静置30min，弃上清液加入预冷的Mmg溶液重新悬浮原生质体，并通过细胞计数板计数；

(6)将步骤(5)中原生质体装至圆底离心管，加入载体；轻轻混匀，再加入等体积的40％PEG-Ca²⁺溶液，轻轻上下颠倒混匀，室温静置18min后加入两倍体积的W5溶液终止转化；

(7)将步骤(6)中的混合物低速离心后吸去40％PEG-Ca²⁺溶液，加入等体积W5溶液，低速离心，去上清液，然后加入等体积W5溶液，再次低速离心后吸去W5溶液，加入等体积WI溶液，轻轻混匀，低速离心；然后转移至培养板孔中，25℃恒温黑暗培养14-16h。