[发明专利]一种血浆中α1微球蛋白的提取方法

说明书

本发明公开了一种血浆中α1微球蛋白的提取方法，依次进行以下步骤制得，1）取α1微球蛋白免疫后的羊血浆，沉降后初步分离血细胞等多种物质；2）离心取上清，采用硫酸铵沉淀至溶液硫酸铵终饱和浓度达到33%（w/v）使血清充分沉淀；3）分离沉淀充分复溶，透析和浓缩；4）利用凝胶过滤层析柱对步骤3）处理过的滤液进行初步分离，收集含有α1微球蛋白的洗脱液；5）利用Protein G亲和层析柱对步骤4）收集到的洗脱液进行亲和层析，收集滤液进行除盐、浓缩处理后即得α1微球蛋白；6）利用SDS‑PAGE鉴定α1微球蛋白纯度。本方法步骤简单，安全性高，稳定性高且获得蛋白纯度较高，适合实验室及中试放大生产。

技术领域

本发明属于蛋白质分离纯化领域，尤其是涉及一种血浆中α1微球蛋白的提取方法。

背景技术

α1微球蛋白（alpha 1-microglobulin，α1-MG）是人体内相对分子质量约26000 ~33000KDa的小分子糖蛋白，通常由182个氨基酸残基组成，最早由 Ekstrom 等从慢性镉中毒患者的尿液中分离、提纯得到，电泳时位于α1区带而得名。其独特的大小和电荷的不均一性，使功能变得十分重要。作为判断肝脏及肾脏功能的重要指标，在体内分布广泛，主要由肝细胞或淋巴细胞特异性合成后，随血液运输分配到体内各种组织中。在血液中，α1微球蛋白主要存在形式有游离、与免疫球蛋白IgA或白蛋白结合形式存在。当重度肝功能损害时，由于肝细胞受损，使肝脏合成、代谢和分泌α1-MG 减少，肝病患者血清中 α1-MG 含量降低。游离型α1-MG能自由地通过肾小球滤过膜，但在近曲小管处因重吸收作用几乎又被吸收，同时结合形式的α1-MG不能通过肾小球滤过，正常情况下人的尿液中只可以检测到游离型α1-MG的存在，一旦由于肾小球滤过功能受损或肾小管重吸收和代谢能力降低，就会导致结合形式α1-MG 更多地由血液释放到尿液中，引起α1-MG的含量增高。因此，α1-MG作为筛查早期肾病、肝病的重要指标，在临床，门诊及健康诊断等多方面被广泛应用。

由于 α1-MG 在疾病诊断上有广泛的应用，因此开发高效的纯化方案具有显著的现实意义和应用价值。现有报道的相关的提纯方法均比较复杂，操作繁琐且费用高，见沈新义等《人尿液α1—微球蛋白的分离,纯化及鉴定》（第二军医大学学报,1992,13），所用的传统的纤维介质DE52/CM52，流速慢，重生效果差，寿命短，不适合量化生产。

发明内容

本发明所要解决的问题就是提供一种血浆中α1微球蛋白的提取方法，为制备诊断试剂盒中抗体原料提供基础，其技术方案如下：

一种血浆中α1微球蛋白的提取方法，包括以下步骤：

1）取α1微球蛋白抗原免疫后的新鲜羊血浆，待血液凝固后，取血浆离心除去纤维蛋白原及某些凝血因子后分离出淡黄色透明液体-血清；

2）虹吸法吸出上层淡黄色透明液体，采用硫酸铵沉淀法沉淀至溶液硫酸铵终饱和浓度达到33%（w/v）。血清充分沉淀后，采用pH7.5的磷酸钾缓冲液复溶沉淀，采用生理盐水溶液透析，采用PEG20000浓缩蛋白。

3）取装有sephadex G100填料的色谱柱，用pH7.5的磷酸钾缓冲液作为平衡缓冲液平衡所述色谱柱，上样，然后用相同缓冲液以0.5 mL/min洗脱，收集洗脱液，用PEG20000浓缩收集液。