[发明专利]一种用于测定人循环血外泌体环状RNA的方法及其试剂盒在审
| 申请号： | 201910258172.1 | 申请日： | 2019-04-01 |
| 公开（公告）号： | CN109957621A | 公开（公告）日： | 2019-07-02 |
| 发明（设计）人： | 王红阳;李亮;危晏平;梁驰;任一彬 | 申请（专利权）人： | 中国人民解放军海军军医大学国家肝癌科学中心 |
| 主分类号： | C12Q1/6886 | 分类号： | C12Q1/6886;C12Q1/6851 |
| 代理公司： | 上海申新律师事务所 31272 | 代理人： | 车超平 |
| 地址： | 201805 上*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 环状RNA 逆转录产物 血浆样本 试剂盒 循环血 肝癌 扩增产物分析 逆转录反应 人血浆样本 特异性引物 诊断标记物 总RNA抽提 高危人群 健康人群 快速定量 扩增引物 目的基因 表达量 静脉血 人血浆 人血清 总RNA 肿瘤 采集 诊断 监测 应用 优化 分析 | ||
1.一种用于测定人循环血样本外泌体环状RNA的试剂盒，其特征在于，包括如SEQ IDNO:1-SEQ ID NO:2所示序列的扩增引物和如SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:4所示序列的内参引物。
2.一种用于非诊断目的的测定人循环血外泌体中环状RNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、采集人静脉血，离心，收集血浆样本；
步骤二、对步骤一收集的血浆上清进行外泌体分离及RNA抽提，以获得RNA样品；
步骤三、测定步骤二中获得的RNA样品的浓度，并取适量的RNA样品进行逆转录反应，以获得逆转录产物cDNA；
步骤四、采用如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:2所示序列的扩增引物对步骤三中获得的逆转录产物cDNA进行PCR扩增，并根据扩增产物分析测定外泌体中环状RNA的含量。
3.根据权利要求2所述的测定人循环血外泌体环状RNA的方法，其特征在于，所述步骤三中，所述逆转录反应体系中包括反应液、逆转录酶、不含核酸酶的水、RNA样品，所述逆转录反应程序包括：引发25℃5分钟，逆转录46℃20分钟，逆转录酶失活95℃1分钟。
4.根据权利要求2所述的测定人循环血外泌体环状RNA的方法，其特征在于，所述步骤四中，所述PCR扩增体系包括反应混合物、扩增引物、水、逆转录产物cDNA；所述PCR扩增程度包括：预温育，1个循环，95℃600秒；三步扩增，40个循环，变性95℃5秒、退火60℃30秒、延伸72℃60秒；融解，1个循环，95℃10秒，65℃60秒，97℃1秒；冷却，1个循环，37℃30秒。
5.根据权利要求2或4所述的测定人循环血外泌体环状RNA的方法，其特征在于，所述扩增引物针对Circ-CDYL的首尾相连接头序列设计。
6.根据权利要求2或4所述的测定人循环血外泌体环状RNA的方法，其特征在于，所述PCR扩增体系位于PCR孔板上，每个反应孔设置2个复孔，配制过程将所述PCR孔板置于冰上，配制完成后水平离心，将侧壁液体离心至孔底。
7.根据权利要求2或4所述的测定人循环血外泌体环状RNA的方法，其特征在于，在所述步骤四中，还设置内参PCR扩增反应组，其采用如SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:4所示序列的内参引物，所述内参引物针对β-actin内参设计。
8.根据权利要求2所述的测定人循环血外泌体环状RNA的方法，其特征在于，在所述步骤二中，血浆上清使用PVDF膜滤器过滤，除去外泌体以外大粒径的微粒。
9.根据权利要求2或3所述的测定外泌体环状RNA的方法，其特征在于，所述步骤二中，用于检测的血浆用量为2ml，用于逆转录的RNA样品中总RNA的量为100-200ng。
10.一种人循环血外泌体环状RNA作为肝癌的诊断标记物的应用，其特征在于，所述环状RNA为Circ-CDYL。
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