[发明专利]一种用于测定人循环血外泌体环状RNA的方法及其试剂盒

说明书

本发明涉及一种用于测定人循环血中外泌体环状RNA的方法及试剂盒，该方法包括：采集人静脉血，离心，收集血浆样本；对血浆样本进行外泌体分离及总RNA抽提，获得总RNA样品；测定RNA样品的浓度，并取适量的RNA样品进行逆转录反应，获得逆转录产物cDNA；采用如SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:2的扩增引物对逆转录产物cDNA进行PCR扩增，并根据扩增产物分析测定外泌体中环状RNA的含量。本发明还涉及一种人血清外泌体环状RNA Circ‑CDYL作为肝癌的诊断标记物的应用。本发明通过对人血浆外泌体分离及RNA抽提步骤的优化，并针对目的基因设计特异性引物，可从少量人血浆样本中分离外泌体，快速定量环状RNA的表达量，并可通过分析肿瘤等病人与健康人群的环状RNA的差异，用于肝癌的诊断和高危人群监测。

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，尤其涉及一种用于测定人循环血中外泌体环状RNA的方法及其试剂盒。

背景技术

环状RNA(circular RNA，circRNA)是区别于传统线性RNA的RNA家族新成员，具有闭合环状结构，其是一种广泛存在的特殊的稳定RNA分子，可以参与调控哺乳动物的基因表达，具有生物学功能的非编码RNA。

外泌体(Exosomes)是脂质双分子层膜性囊泡，是由活细胞内多泡体(multivesicular body，MVB)与细胞膜融合后释放到细胞外隙或生物体液中，大小介于30～100nm之间，包含有蛋白质、RNA、microRNA和DNA片段等多种成分，已有研究明确表明外泌体内含有大量环状RNA。除了细胞来源的外泌体外，研究也发现人循环血外泌体也含有大量完整稳定的环状RNA，并且相关癌症(如结直肠癌)病人循环血外泌体中的环状RNA与正常人差异明显，因此，人循环血外泌体环状RNA有望成为癌症检测的潜在生物标志物。

最新研究还构建了人类MHCC-LM3肿瘤细胞的小鼠异种移植体模型，其在在血清中稳定检测到了人类CDYL circRNA。但目前尚未有能够准确定量人循环血外泌体环状RNA的方法。

发明内容

为了于克服现有技术中的缺陷，本发明提供一种用于测定外泌体环状RNA的方法及其试剂盒，其从少量人血浆样本中分离外泌体，快速定量环状RNA的表达量，进行相关的课题研究和学术论证，也可通过分析肿瘤等病人与健康人群相比较环状RNA的差异，用于肿瘤的诊断和高危人群监测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种用于测定人循环血外泌体环状RNA的试剂盒，其包括如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:2所示序列的扩增引物和如SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:4所示序列的内参引物；其中，所扩增引物针对Circ-CDYL的首尾相连接头序列设计，所述内参引物针对β-actin内参设计；其中，所述Circ-CDYL母基因的第二号外显子全长序列如SEQID NO:5所示。

上述序列具体如下：

本发明的第二个目的是提供一种用于非诊断目的的测定人循环血外泌体环状RNA的方法，其包括如下步骤：

步骤一、采集人静脉血，离心，收集血浆样本；

步骤二、对步骤一收集的血浆上清进行外泌体分离及RNA抽提，以获得RNA样品；

步骤三、测定步骤二中获得的RNA样品的浓度，并取适量的RNA样品进行逆转录反应，以获得逆转录产物cDNA；

步骤四、采用如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:2的扩增引物对步骤三中获得的逆转录产物cDNA进行PCR扩增，并根据扩增产物分析测定外泌体中环状RNA的含量。

为了进一步优化上述方法，本发明采取的技术措施还包括：