[发明专利]一种对过氧化氢特异性响应的基因编码型荧光生物探针及其构建方法和用途

说明书

本发明公开了一种对过氧化氢特异性响应的基因编码型荧光生物探针及其构建方法和用途，对过氧化氢具有特异性响应的基因编码型荧光探针是通过将对过氧化氢特异性敏感的PrxA和TrxA分别融合到cpYFP荧光蛋白的两端构成。本发明荧光探针对过氧化氢具有高灵敏性和选择性，在胞内和胞外均能迅速响应过氧化氢，特别是该探针是一种基因编码型探针，能够组成型表达，实现实时动态检测胞内过氧化氢浓度的变化以及用于细胞成像，对于研究氧化还原代谢相关信号通路具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于荧光生物探针及其检测过氧化氢的方法领域，尤其涉及一种对过氧化氢特异性响应的基因编码型荧光生物探针及其构建方法和用途。

背景技术

活性氧(ROS)曾被认为对细胞是致死的，但是现在被认为是一种参与多种氧化还原信号传导的分子，对细胞的正常功能和疾病的发生均有贡献。胞内低水平的ROS能够作为信号分子。当胞内产生的ROS含量远超过胞内一系列抗氧化系统的抗氧化能力范围时，ROS的水平会进一步增加。后者与氧化应激和相关的信号传导的诱导有关，并且其特征在于ROS诱导的细胞内氧化还原稳态的变化和/或对生物分子(例如DNA、蛋白和脂质)的破坏作用。因为ROS的产生和除去涉及复杂的机制，以及能够对某一种类型的活性氧具有真正特异性的报告分子的缺乏，定量胞内和亚细胞结构内的ROS的水平是一项具有挑战性的工作。

ROS的一个主要成分过氧化氢，多年来被认为是好氧生物不可避免的但又是不期望的副产物，如果消耗的更快对细胞更有利。但是近来更多的被各大研讨会强调，哺乳动物能够通过产生过氧化氢介导多种不同的生理反应，比如细胞增殖、分化和迁移等。这个过程意味着“氧化还原”在细胞正常过程和疾病进展，如血管生成、氧化应激和衰老以及癌症等过程中起着信号作用。一种简单高灵敏度的过氧化氢检测方法具有广泛的分析应用价值。不论在监测食品、消费品和环境水，如雨水，中低水平的过氧化氢，还是在检测过氧化氢水平来研究其是否作为信号传导分子还是诱导很多疾病的发生方面都具有重要的地位。

荧光探针是活体细胞实时成像的一个基石以及是细胞生物学上的一个强有力的工具。源于荧光蛋白的基因编码的探针在实时观测和追踪胞内不同过程中正起着引领革命的作用。最近的一些进步，包括用于测量活体细胞中生物分子的表达和定位的“被动”标记物的不断发展，和开发的监测更复杂的胞内过程，如小分子信使的动力学变化过程、蛋白酶激活过程和蛋白-蛋白间相互作用过程等，指示器的不断出现，都推动了荧光蛋白的细胞生物学方面的发展。

为了在胞内检测过氧化氢这一重要的信号分子，相关报道的基因编码型探针也已经有被开发出来，但是响应更加快速、更灵敏以及更准确的生物探针还有待被开发，进而弥补现有过氧化氢检测方法存在的不足，以及对推动氧化还原信号传导的研究、生理和病理的研究具有重要意义。

发明内容

本发明的目的就是针对现有过氧化氢检测方法的不足，通过基因融合的手段构建一种能在体内、体外均对过氧化氢具有高灵敏性和高选择性的基因编码型荧光生物探针的构建方法。

本发明的第二个目的在于提供一种对过氧化氢特异性响应的基因编码型荧光生物探针。

本发明的第三个目的在于提供一种多核苷酸分子。

本发明的第四个目的在于提供一种重组质粒。

本发明的第五个目的在于提供对过氧化氢特异性响应的基因编码型荧光生物探针的应用。

为了实现上述目的，本发明提供了一种对过氧化氢特异性响应的基因编码型荧光生物探针的构建方法，其特征在于，所述构建方法为将对过氧化氢特异性敏感的PrxA和TrxA分别融合到cpYFP荧光蛋白的两端。

作为一个优选方案，先将TrxA氨基酸序列的半胱氨酸替换为极性氨基酸，得到TrxA突变体再进行融合。

作为一个优选方案，所述极性氨基酸包括谷氨酰胺，天门冬酰胺，丝氨酸，络氨酸，精氨酸，组氨酸，赖氨酸，天门冬氨酸和谷氨酸中的任意一种。