[发明专利]一种基于Transwell孔板上室培养细胞下室吸附分离外泌体的方法和应用

说明书

本发明涉及一种基于Transwell孔板上室培养细胞下室吸附分离外泌体的方法和应用，属于生物医学技术领域。本发明首先配制含有大量氨基正离子的水溶性聚合物溶液，灭菌后转移至Transwell孔板下室；然后将具有分泌外泌体能力的细胞转移至装有完全培养基的Transwell孔板上室进行细胞培养；上室细胞孵化过程中分泌外泌体的同时由于静电和渗透压作用，外泌体穿过孔板被下室内聚合物牢牢抓住，再通过离心处理除去混入下室的小粒径杂质，从而实现外泌体自发分离的目的，分离效率高。另外，本发明还可根据不同的实验目的，可通过去质子化和离心处理将外泌体进一步从材料中分离，便于后续的分子分析和应用。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，更具体地说，本发明涉及一种基于transwell孔板上室培养细胞下室吸附分离外泌体的方法和应用。

背景技术

外泌体于1983年首次被发现，是由细胞主动分泌到细胞外基质中，呈茶托形或一侧凹陷的生物活性磷脂双分子层小囊泡，直径在30-15nm，且携带蛋白质、脂质、核酸等物质，可反映来源细胞的生理、病理情况，在多种生物状态与疾病中发挥着重要的生理病理学功能。近些年研究表明外泌体在细胞间信息传递、抗原呈递以及蛋白质核酸物质交换等起到重要的作用。特别是外泌体参与细胞间免疫信号、血管生成、增值和分化等功能，直接影响了诸如肿瘤、神经退行性疾病等的发生，因而外泌体被视为分析生物信息特征的指纹。然而，关于外泌体生物学的作用机制等根本问题仍然未得到有效解决。因而需要深入地研究外泌体独特的生物学结构和功能，探讨这些结构相关的生物学机制。但对不同来源的外泌体进行分离提纯是阻碍外泌体研究的第一道门槛。因此对外泌体有效的提纯方法研究迫在眉睫。

目前现有的外泌体分离方法主要是依据外泌体自身所具有的物理和生物学特点，主要包括：1、基于外泌体密度不同的离心方法，如差速离心法、密度梯度离心法、超速离心法等；2、基于外泌体大小的过滤方法，如超滤法、分子排阻色谱法；3、免疫亲和抓取以及PEG沉淀试剂盒等三类方法。虽然这些分离方法为研究外泌体提供了极大的方便，但是也都存在较为明显的缺点。超速离心法是目前分离外泌体最常用的方法，具有操作简单，产量适中，应用广泛等优势。超速离心法的缺点是，离心机设备成本高，耗时长，重复离心可能会损坏囊泡膜结构，并且得到的外泌体中含有大量的蛋白质污染。其次，滤膜过滤法虽然已经有产品推出，但分离的时候会产生蛋白质堵塞膜孔，外泌体破裂等一系列问题。分子排阻色谱法则需要专门的仪器，并且极其耗时。免疫亲和抓取的方法虽然可以获得较高纯度的外泌体，但是使用范围小，同时成本高，产量低，也不适合广泛应用。PEG沉淀法是目前成本最低，容易操作，也可用于大容量样本。但是问题也较多：例如沉淀时间较长，沉淀中杂质蛋白较多，纯度和回收率低，颗粒大小不均匀，引入的聚合物难以除去等缺点。

基于上述理由，提出本申请。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于Transwell孔板上室培养细胞下室吸附分离外泌体的方法和应用。本发明方法可实现在细胞培养的过程中自发地分离外泌体，且分离效率高。

为了实现本发明的上述第一个目的，本发明采用的技术方案如下：

一种基于Transwell孔板上室培养细胞下室吸附分离外泌体的方法，首先配制含有大量氨基正离子的水溶性聚合物溶液，灭菌后转移至Transwell孔板下室；然后将具有分泌外泌体能力的细胞转移至装有完全培养基的Transwell孔板上室，并在低氧条件下进行细胞培养；上室细胞孵化过程中在低氧刺激下分泌外泌体的同时由于静电作用和渗透压作用，外泌体穿过孔板被下室内聚合物牢牢抓住；细胞培养结束后，收集下室聚合物溶液进行第一低速离心处理，得到含有外泌体的聚合物溶液。

进一步地，上述技术方案还包括将所得含有外泌体的聚合物溶液依次进行去质子化、第二低速离心处理，最终收集得到纯化外泌体的步骤。