[发明专利]一种靶向治疗肿瘤的重组融合蛋白及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种靶向治疗肿瘤的重组融合蛋白，其特征在于：所述重组融合蛋白是由穿膜肽、转铁蛋白N端结构域与重组豹蛙抗瘤酶融合而成的重组融合蛋白9R-rONC-TFn和9R-TFn-rONC，其对应的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

2.一种权利要求1所述的靶向治疗肿瘤的重组融合蛋白编码基因，其特征在于：所述重组融合蛋白9R-rONC-TFn和9R-TFn-rONC编码基因的核苷酸序列分别如序列表中SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示。

3.根据权利要求2所述的靶向治疗肿瘤的重组融合蛋白编码基因，其特征在于：所述靶向治疗肿瘤的重组融合蛋白编码基因由重组豹蛙抗瘤酶核苷酸序列与穿膜肽和转铁蛋白N端结构域基因片段通过连接肽连接而成。

4.根据权利要求3所述的靶向治疗肿瘤的重组融合蛋白编码基因，其特征在于：所述连接肽为GS linker((Gly₄Ser)₃)。

5.一种含有权利要求2或3所述的靶向治疗肿瘤的重组融合蛋白编码基因的表达载体和表达载体的宿主细胞，其特征在于：所述表达载体为pET27b(+)，宿主细胞为Rossetta(DE3)。

6.一种权利要求1所述的靶向治疗肿瘤的重组融合蛋白的制备方法，其特征在于具体过程为：将编码重组融合蛋白9R-rONC-TFn和9R-TFn-rONC的两种核苷酸序列分别与表达载体相连接得到重组表达载体；再将重组表达载体分别转化宿主细胞；分别筛选高表达阳性宿主细胞，分别培养细胞并诱导表达重组融合蛋白，收集菌体、破碎、离心、变性、复性、纯化得到靶向治疗肿瘤的重组融合蛋白。

7.根据权利要求6所述的靶向治疗肿瘤的重组融合蛋白的制备方法，其特征在于：将重组表达载体分别转化表达菌株Rosseta(DE3)，转化后的单菌落分别接种至20mL含50μg/mLKan的LB培养基中，于37℃培养8h，以体积比1:100接种于另一20mL含50μg/mL Kan的LB培养基中，于37℃培养，当A₆₀₀在0.35时，在温度为37℃、IPTG终浓度为0.25mmol/L、转速为80r/min的条件下诱导6h，在此条件下进行表达重组融合蛋白9R-rONC-TFn和9R-TFn-rONC时，能够显著提高重组融合蛋白的表达水平。

8.根据权利要求6所述的靶向治疗肿瘤的重组融合蛋白的制备方法，其特征在于：将重组表达载体分别转化宿主细胞，筛选高表达阳性克隆，培养并诱导表达重组融合蛋白9R-rONC-TFn和9R-TFn-rONC，通过中空纤维柱膜过滤技术对菌体进行富集，破碎，离心，上清液调pH值至6.0利用SP Sepharose 6FF亲和层析，Superdex 75凝胶过滤层析分离纯化得到靶向治疗肿瘤的重组融合蛋白。

9.权利要求1所述的靶向治疗肿瘤的重组融合蛋白作为靶向治疗肿瘤药物的用途，该靶向治疗肿瘤的重组融合蛋白作为靶向治疗肿瘤药物的稳定性高且半衰期长，具有良好的肿瘤细胞穿透能力和肿瘤细胞靶向作用，并且活性显著提高。