[发明专利]一种同时检测车前草花叶病毒和百合X病毒的试剂盒在审
申请号: | 201910263705.5 | 申请日: | 2019-04-03 |
公开(公告)号: | CN109913588A | 公开(公告)日: | 2019-06-21 |
发明(设计)人: | 金玲;陈枫;陈冬;刘晓梅;钱忠兰 | 申请(专利权)人: | 淮安市洪泽区农业干部学校 |
主分类号: | C12Q1/70 | 分类号: | C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11 |
代理公司: | 福州元创专利商标代理有限公司 35100 | 代理人: | 蔡学俊;饶文君 |
地址: | 223100 江*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 病毒 试剂盒 车前草花 百合 检测 反向引物 正向引物 病毒基因组 特异性引物 保守区域 病毒检测 单个样品 反应条件 反转录酶 特异性强 阳性对照 阴性对照 灵敏度 一次性 筛选 节约 应用 优化 | ||
1.一种同时检测车前草花叶病毒和百合X病毒的引物对,其特征在于:所述引物对序列如下所示:1)PlAMV正向引物: 5’-CCTTGCCCTGGTCAACGCAT-3’;2)PlAMV反向引物: 5’-TCTCGTTTGCTGTGACCTCG-3’;3)LVX正向引物: 5’-CCAATTTCTTCGATGTGGCGTTC-3’;4)LVX反向引物: 5’-GCTCGGCCATGGGTAATCTCA-3’。
2.包含权利要求1所述的引物对的同时检测车前草花叶病毒和百合X病毒的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的同时检测车前草花叶病毒和百合X病毒的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒包括:
1)PlAMV正向引物:10μmol/L,引物序列为5’-CCTTGCCCTGGTCAACGCAT-3’;2)PlAMV反向引物:10μmol/L,引物序列为5’-TCTCGTTTGCTGTGACCTCG-3’;3)LVX正向引物:10μmol/L,引物序列为5’-CCAATTTCTTCGATGTGGCGTTC-3’;4)LVX反向引物:10μmol/L,引物序列为5’-GCTCGGCCATGGGTAATCTCA-3’;5)RT Buffer:5×;6)RNA酶抑制因子:40U/μL;7)反转录酶:200U/μL;8)dNTPs:10mmol/L;9)PCR Mix:2×;10)车前草花叶病毒阳性对照样品;11)百合X病毒阳性对照样品;12)不含车前草花叶病毒、百合X病毒的阴性对照样品;13)RNase-freeddH2O。
4.利用权利要求2或3所述的同时检测车前草花叶病毒和百合X病毒的检测方法,其特征在于:包括以下步骤:
1)反转录:向PCR反应管中加入待测样品总RNA 3μL、10mmol/L PlAMV反向引物1μL、10mmol/L LVX反向引物1μL和RNase-free ddH2O 6μL,70℃水浴10min后冰浴5min,再依次加入下列试剂:5× RT Buffer 5μL、10mmol/L dNTPs 2μL、200U/μL反转录酶1μL、40U/μLRNA酶抑制因子1μL,42℃水浴60min后70℃下10min后冷却至室温,合成cDNA;
2)PCR:向PCR反应管中加入反转录合成的cDNA 3μL、2×PCR Mix 12.5μL、10mmol/LPlAMV正向引物1μL、10mmol/L PlAMV反向引物1μL、10mmol/L LVX正向引物1μL、10mmol/LLVX反向引物1μL、RNase-free ddH2O 5.5μL;混合后的反应液,94℃预变性3min, 然后94℃变性30s、56℃ 退火45s、72℃延伸1 min,共35个循环,最后一个循环结束后72℃下10min;
3)PCR产物检测:取PCR产物10μL用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测,当PCR扩增产物中含有大小为338bp的片段,则所述待测样品含有车前草花叶病毒,反之则所述待测样品不含有车前草花叶病毒;当PCR扩增产物中含有大小为439bp的片段,则所述待测样品含有百合X病毒,反之则所述待测样品不含有百合X病毒;当PCR扩增产物中含有大小为338bp、439bp的片段,则所述待测样品同时含有车前草花叶病毒、百合X病毒,反之则所述待测样品同时不含有车前草花叶病毒、百合X病毒。
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