[发明专利]一种同时检测车前草花叶病毒和百合X病毒的试剂盒

说明书

本发明涉及一种同时检测车前草花叶病毒和百合X病毒的试剂盒，包括PlAMV正向引物、PlAMV反向引物、LVX正向引物、LVX反向引物、RT Buffer、RNA酶抑制因子、反转录酶、dNTPs、PCR Mix、阳性对照、阴性对照和RNase‑free ddH₂O。本发明利用车前草花叶病毒和百合X病毒基因组的保守区域设计、筛选特异性引物，经反应条件的反复优化，研制了能够同时检测两种病毒的试剂盒。该试剂盒具有操作简单、灵敏度高、特异性强和稳定性好的优点，实现了两种病毒一次性同时快速检，有效节约了检测成本，减少了单个样品的病毒检测费用，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别是一种同时检测车前草花叶病毒和百合X病毒的试剂盒，适用于农业生产上车前草花叶病毒和百合X病毒的快速检测。

背景技术

百合是百合科（Liliaceae）百合属（Lilium）多年生草本球根植物，具有重要的观察、食用和药用价值。近年来，随着栽培品种和面积的不断增大，病毒病的发生逐渐加重。根据国内外报道，百合上发生的病毒种类有20多种，且发病率较高，可达40-50%。其中，车前草花叶病毒（Plantago asiatica mosaic virus, PlAMV）和百合X病毒（Lily virus X, LVX）都属于甲型线状病毒科（Alphaflexiviridae）、马铃薯X 病毒属（Potexvirus) 成员。PlAMV最早于1994年俄罗斯远东地区的车前草上被发现。PlAMV为正义单链RNA病毒，其基因组全长约为6101bp。该病毒寄主范围较广，除侵染车前草外，主要侵染百合、报春花等花卉。2010年首次在荷兰百合发现和报道，目前已成为百合的主要病毒之一。PlAMV主要通过机械传播，并能经种球远距离传播，目前尚不清楚是否存在有传播介体。该病毒侵染引起的症状根据寄主的不同而各异，在车前草上造成花叶和褪绿等症状，在百合中引起叶脉褪绿成锈色，产生坏死斑，严重时蔓延至整个叶片，导致坏死及花蕾枯死。百合X病毒（LVX）最初是在英国的百合中被发现和报道。LVX病毒粒体为线状，为正义单链RNA病毒，其基因组全长约5823bp，自然寄主为百合属植物，LVX单独侵染百合表现为无病，无病症病状，经常与百合无症病毒（Li ly symptomeless virus , LSV）、百合斑驳病毒（Li ly mot t le virus , LMoV）等其他病毒复合侵染百合，引起叶片出现黄色条纹、畸形、植株矮化和枯死等症状。LVX可在百合种球中不断累积，通过带毒种球传播是其远距离传播的重要途径。

PlAMV、LVX两种病毒侵染百合引起的病毒病均是百合生产上的重要病害。据报道，PlAMV在百合种植温室中发生导致叶片坏死，可造成80%切花丧失商业价值。目前，PlAMV主要分布于荷兰、日本、美国、意大利等地，我国大陆尚未有该病毒的报道。LVX是百合上危害大、发生率高的病毒之一，严重影响百合花卉的品质，能造成严重的经济损失。目前，LVX主要分布于荷兰、英国、美国和日本等，该病毒在国内尚未有相关报道。考虑到PlAMV、LVX的危害严重性，建立快速、有效的检测方法，对于防范两种病毒的发生和危害具有非常重要的意义。用于PlAMV、LVX检测的方法主要包括生物学测定、电子显微镜观察、酶联免疫吸附测定法和分子生物学检测方法，但至今尚未见用于同时检测PlAMV、LVX两种病毒的双重RT-PCR方法，更未见基于该方法的检测试剂盒。双重RT-PCR方法不但一次同时检测百合上复合侵染PlAMV、LVX的样品，而且可以鉴定单独侵染百合的PlAMV或LVX。利用双重RT-PCR检测PlAMV、LVX，通过一次实验即可实现对PlAMV、LVX两种病毒的同时检测，准确鉴定PlAMV、LVX是单一侵染还是复合侵染。

发明内容