[发明专利]液质联用检测尿液中环磷酸腺苷的方法

权利要求书

1.一种液质联用检测尿液中环磷酸腺苷的内标定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）溶液配置和样本前处理：

配制一系列浓度梯度的cAMP标准溶液及一定浓度的cAMP内标溶液；

用阴离子交换固相萃取对添加cAMP内标溶液的尿液样本进行前处理，得到供试品溶液；

用阴离子交换固相萃取对分别添加cAMP内标溶液的一系列浓度梯度的cAMP标准溶液进行前处理，得到一系列的对照品溶液；

（2）采用液质联用检测所述供试品溶液和对照品溶液：

其中，液相色谱条件为：色谱柱采用色谱柱为ACQUITY UPLC ®HSS T3 1.8 µm, 2.1mm×50 mm；流动相包括流动相A和流动相B；流动相A为0.005~100 mM乙酸盐水溶液，所述乙酸盐选自乙酸铵、乙酸钾、乙酸钠中的一种或多种；流动相B为乙腈、或甲醇、或乙腈与甲醇的混合液；采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：流动相A+流动相B=100%，0～1.00 min，流动相B体积百分比维持在20%；1.00～1.5 min，流动相B体积百分比由20%增至40%；1.50～1.80min，流动相B体积百分比由40%递增至90%；1.80～1.81min，流动相B体积百分比由90%递减至20%；1.81～3.00 min，流动相B保持体积百分比为20%；液相色谱的柱温为25~35℃，进样量为2~5μL，流速为0.3~2mL/min；

质谱条件为：离子源为电喷雾离子源；离子模式为正离子模式；监测模式为多反应监测；

（3）定量测定方法：

将所述对照品溶液以及供试品溶液按所述步骤（2）中色谱条件依次进样，记录色谱图；将对照品溶液中cAMP对其内标物的峰面积的比值与cAMP浓度进行线性回归产生标准曲线，或由质谱软件系统自动生成标准曲线；将供试品溶液中cAMP对其内标物的峰面积的比值代入至所述标准曲线，计算得到尿液样本中cAMP浓度，或由质谱软件系统给出样本中cAMP浓度。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述尿液样本经上样、淋洗，然后用体积分数10-30%甲酸水溶液洗脱，收集的洗脱液用碱中和后，得到供试品溶液。

3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，流动相A中乙酸盐水溶液的浓度为0.005~1 mM。

4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，流动相A中乙酸盐水溶液的浓度为0.005~0.5 mM。

5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，流动相A中乙酸盐水溶液的浓度为0.005~0.05 mM。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，液相色谱的柱温为25℃。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，质谱条件设置，驻留时间为0.079s，锥孔电压为20V，碰撞能量为30V，定性离子对为cAMP：330.0→119.2，cAMP-IS：359.1→147.8，定量离子对为cAMP：330.0→136.2，cAMP-IS：359.1→164.7。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，一系列浓度梯度的cAMP标准溶液的浓度分别为：1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，cAMP内标溶液浓度为0.005~0.5nmol/mL。