[发明专利]酵母表达载体构建及表达外切型纤维素酶的方法与应用

权利要求书

1.一种酵母表达载体构建方法，其特征在于，其步骤为：

(1)对外切型纤维素酶基因片段进行密码子优化，两端加入EcoR I和Xba I酶切位点并合成新的基因序列如SEQ ID NO.1；

(2)利用限制性内切酶EcoR I和Xba I对基因序列如SEQ ID NO.1的外切型纤维素酶基因片段进行双酶切，胶回收外切型纤维素酶基因片段；

(3)利用与步骤2中相同的限制性内切酶双酶切表达载体pPICZαA；

(4)将步骤2中胶回收的外切型纤维素酶基因片段与步骤3中切后的pPICZαA载体连接，通过热击法导入大肠杆菌感受态细胞DH5α构建得到重组表达载体pPICZαA-Cel7A，再利用质粒提取试剂盒从重组大肠杆菌中提取表达载体质粒pPICZαA-Cel7A。

2.如权利要求1所述的构建方法构建的一种酵母表达载体，其特征在于，基因序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种如权利要求2所述的酵母表达载体制备外切型纤维素酶的方法，其特征在于，其步骤为：

(1)提取所述重组表达载体pPICZαA-Cel7A，利用限制性内切酶Sac I对pPICZαA-Cel7A载体进行线性化，反应体系为：10×QuickCut buffer 5μL，Sac I1μL，质粒8μL，灭菌水36μL，37℃孵育15min；

(2)将线性化的pPICZαA-Cel7A载体通过电穿孔仪转入酵母菌X33，条件：电压，2-2.5kv；时间，4-6ms；之后再置于含山梨醇0.5-1mol/L，博来霉素0.1-1μL/mL的YPD培养基中培养，筛选含外切型纤维素酶基因的重组酵母菌菌落；

(3)将筛选出含外切型纤维素酶基因的重组酵母菌菌落加入YPD培养基中到30℃震荡培养至浑浊；将菌液全部进入到BMGY培养基中，30℃震荡培养过夜；将菌体加入到含1.5-2.0L发酵基础盐培养基的6L发酵罐中，培养20-28小时，待甘油耗尽，溶氧量大于60％，补加甘油培养基培养，流速为5-15毫升/每小时每初始培养液体积，4-12小时停止；2-3小时后开始补加甲醇培养基，流速为3-10毫升/每小时每初始培养液体积，保证溶氧量不低于20％，持续培养72-120小时，培养终止后，将培养液离心，上清液过0.45μm滤膜，再经浓缩系统浓缩和Ni柱亲和层析，获得纯化的外切型纤维素酶。

4.一种如权利要求3所述的酵母表达载体制备外切型纤维素酶的方法，其特征在于：

所述BMGY培养基组成为，1％酵母粉，2％蛋白胨，1.34％酵母氮源基础，4×10-5％生物素，100mM磷酸钠缓冲液，pH 6.0，1％甘油；

所述发酵基础盐培养基组成为，每升含26.7毫升85％磷酸，0.93克硫酸钙，18.2克硫酸钾，14.9克七水硫酸镁，4.13克氢氧化钾，40克甘油；

所述YPD培养基成分为1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；

所述甘油培养基为纯甘油稀释为50％，再加入微量元素盐培养基，使其浓度为每升甘油含12-13毫升微量元素盐培养基；

所述甲醇培养基为甲醇纯度为100％，再加入微量元素盐培养基，使其浓度为每升甲醇含12-13毫升微量元素盐培养基；

所述微量元素盐培养基组成为，每升含6克五水硫酸铜，0.08克碘化钠，3克一水硫酸锰，0.2克二水钼酸钠，0.02克硼酸，0.5克氯化钴，20克氯化锌，65克七水硫酸亚铁，0.2克生物素，5毫升硫酸，加水至1升。

5.一种如权利要求3或4所述的方法制备的外切型纤维素酶用于提高农作物秸秆瘤胃利用的应用，其特征在于：每克秸秆饲料，添加300-500μg的外切型纤维素酶。