[发明专利]酵母表达载体构建及表达外切型纤维素酶的方法与应用

说明书

本发明公开了一种酵母表达载体构建及表达外切型纤维素酶的方法与应用，利用现代分子技术成功优化了编码香菇外切型纤维素酶的基因序列，构建了能够在酵母体外表达外切型纤维素酶的表达载体pPICZαA‑Cel7A，利用该载体和毕赤酵母能够制备外切型纤维素酶，进而为外切型纤维素酶在生产中的应用提供技术支撑。通过本发明方法获得的重组毕赤酵母菌酶产率高，活性高，效果佳。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种酵母表达载体构建 及表达外切型纤维素酶的方法与应用。

背景技术

目前，我国农业领域每年产生大量的农作物秸秆，以稻草、玉米秸秆、小 麦秸秆为典型代表。这些秸秆中含有大量的纤维素、半纤维素等碳水化合物， 是反刍动物的重要饲料来源(赵蒙蒙等，几种农作物秸秆的成分分析，材料导 报，2011(16)：122-125)。

但是，生产中，这些秸秆并没有被广泛的用于畜牧养殖业，大部分被直接 焚烧(曹国良等，中国区域农田秸秆露天焚烧排放量的估算，科学通报，2007 (15)：1826-183)或腐解还田，不仅浪费了资源，还严重污染环境。主要原因 在于，秸秆中的木质纤维素结构复杂，不能被牛羊等反刍动物有效的利用，降 低了其营养价值。

为提高这些秸秆饲料的利用率，以往生产中多采用酸化、碱化等方式处理 油菜秸秆，但其残留的酸碱，会对动物本身造成伤害，而且污染环境(张文杰 等，秸秆处理方法的研究进展，中国畜牧兽医，2011(07)：30-33)。

与上述化学方法相比，利用能够降解纤维素或半纤维素的酶制剂，则绿色、 安全、无污染，且可提高饲料的适口性和利用率。外切型纤维素酶(Exoglucanase) 是纤维素分解酶系统的重要组成部分，通过作用于纤维素链的还原端或非还原 端，水解纤维底物的结晶部分并降低其聚合度(Teeri T.T.Crystalline cellulose degradation:new insightinto the function of cellobiohydrolases,Trends in Biotechnology,1997,15:160-167)。许多研究调查了外切型纤维素酶的特性及与 其他酶在降解纤维底物上的协同作用。结果显示，外切型纤维素酶与内切型纤 维素酶、木聚糖酶协同促进了稻草、麦秸、玉米秸秆等秸秆的水解。反刍动物 的瘤胃中存在大量的细菌、原虫、真菌，能够分泌包括纤维素酶、半纤维素酶、 木聚糖酶在内的各种分解木质纤维素的酶。将外切型纤维酶添加到瘤胃中，势 必会通过与上述这些酶的协同作用促进秸秆饲料的降解。

因此，寻找能够在瘤胃环境下强化秸秆降解的外切型纤维素酶，是目前亟 待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种酵母表达载体构建及表达外切型纤维素酶的 方法与应用，利用现代分子技术成功优化了编码香菇外切型纤维素酶的基因序 列，构建了能够在酵母体外表达外切型纤维素酶的表达载体pPICZαA-Cel7A，利 用该载体和毕赤酵母能够制备外切型纤维素酶，进而为外切型纤维素酶在生产 中的应用提供技术支撑。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种酵母表达载体构建方法，其步骤为：

(1)对外切型纤维素酶基因片段进行密码子优化，两端加入EcoR I和Xba I酶切位点并合成新的基因序列如SEQ ID NO.1；

(2)利用限制性内切酶EcoR I和Xba I对基因序列如SEQ ID NO.1的外切 型纤维素酶基因片段进行双酶切，胶回收外切型纤维素酶基因片段；

(3)利用与步骤2中相同的限制性内切酶双酶切表达载体pPICZαA；